论文部分内容阅读
猪流感(Swine influenza,SI)是一种猪的急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病,是由猪流感病毒(Swine influenza virus,SIV)引起的.一年四季猪流感都可以发生,但以春秋冬季多发,不同年龄、性别和品种的猪对该病都容易感染,发病率也很高,在临床上以高热、食欲下降、呼吸困难、咳嗽、精神沉郁、迅速康复或死亡为主要特征.美国首次报道SI的暴发是在1918年,Shope在1930年从猪的体内第一次分离到了一株H1N1亚型猪流感病毒,此后世界大部分地区陆续有相关的报道.我国很多地方都有猪流感流行的报道,天津、广东、湖南、甘肃、山东、浙江等地分离鉴定出了H1N1,H1N2,H3N2等亚型的猪流感病毒.但目前关于河南省猪流感的分子流行病学及猪流感病毒的免疫致病机制的研究报道还非常少.因此,对河南省猪流感的研究不仅具有重要的经济意义,而且有重大的公共卫生学意义.本研究从201 1年10月底开始在某猪病门诊采集有呼吸道症状的猪鼻拭子和肺脏,脾脏样品.对有呼吸道症状的猪,用棉拭子取其鼻粘膜分泌物.对于病死猪宰杀猪只,取其气管分泌物、肺脏、肺淋巴结和扁桃体备用.先后共采集到鼻拭子和肺脏样品35份.201 1年]1月份在周口西华某猪场采样,共采集到有呼吸道症状的猪鼻拭子32份.2011年12月和2012年3月两次到漯河某屠宰场随机采集猪鼻拭子360份.将所采集的病料样品经过无菌处理后,接种到10日龄的鸡胚经过传代培养进行病毒的分离.结果表明一共分离到了5株疑似猪流感病毒,经过RT-PCR鉴定,结果表明所分的离毒株有3株是H1N2亚型猪流感病毒,2株是H1N1亚型猪流感病毒,分别命名为A/Swine/Henan/01/2010(H 1N2), A/Swine/Henan/02/2010(H 1N2), A/Swine/Henan/01 /2012(H 1N2),A/Swine/Henan/01/2012 (H 1N1),A/Swine/Henan/02/2012(H 1N1).生物学特性研究显示：检测红细胞凝集谱的试验中发现五株毒株均能凝集鸡、兔、小鼠、猪和牛的红细胞；热稳定性试验结果显示A/Swine/Henan/01/2012(H 1N2),A/Swine/Henan/01/2012(H 1N1),A/Swine/Henan/01/2010(H 1N2)和A/Swine/Henan/02/2010(H 1N2)属于热稳定型,A/Swine/Henan/02/2012(H 1N1)属于中等热稳定型.脂溶剂敏感试验结果显示,5株毒株均对乙醚、氯仿和酸敏感,感染小鼠第四天开始发病.鸡胚的致病力检测结果显示A/Swine/Henan/01/2012(H 1Nl)EID50 =10-4.6, A/Swine/Henan/02/2012(H 1N1) EID50=10-8.22, A/Swine/Henan/01/2012(H 1N2) EID50=10-5.64. A/Swine/Henan/01/2010 (H 1N2)EID50 =10-5.86,, A/Swine/Henan/02/2010(H 1N2) EID50=10-3.83, A/Swine/Henan/01/2012(H1N1)的ELD50=1 0-4.46, A/Swine/Henan/02/2012(H1N1)的ELD50=10-6.16, A/Swine/Henan/01/2012(H1N2)的ELD50 =10-5.54,A/Swine/Henan/01/2010 (H 1N2)ELD50=10-6.54, A/Swine/Henan/02/2010(H1N2) ELD50=10-2.43.A/Swine/Henan/01/2012(H 1N 1),A/Swine/Henan/02/2012(H1N1), A/S wine/Henan/01/2012(H 1N2),A/Swine/Henan/01/2010(H1N2)对鸡胚的致病力较强,A/Swine/Henan/02/2010 (H 1N2)对鸡胚的感染力和致病力较弱.为了进一步研究所分离5株猪流感病毒的遗传进化特征,本试验对分离5株猪流感病毒基因组的8个片段进行RT-PCR扩增,克隆和核苷酸序列测定,进行Blast比对分析后,采用philip 3.64和MEGA5等软件对所得的测定结果进行SIV的遗传特征演化分析.3株H1N2毒株均为新型四源重组病毒,其中HA和NP片段来源于经典猪流感；NA和PB1片段来源于类H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感；值得注意的是,A/swine/Henan/01/2010(H 1N2)毒株NS片段来源于亚洲禽流感,而A/swine/Henan/02/2010(H1N2)和A/swine/Henan/01/2012(H1 N2)毒株NS片段来源于经典猪流感.本试验对2株H1N1亚型病毒A/swine/Henan/01/2012(H1N1)和A/swine/Henan/02/2012(H1N1))全基因组的8个片段进行RT-PCR扩增、克隆和核苷酸序列测定,并对基因序列进行比对分析之后,用MEGA 5软件构建全基因组核苷酸遗传进化树,并对其遗传演化结果进行分析之后,结果表明,两株H1N1亚型毒株为经典猪流感毒株谱系.综上所述,本试验对河南省部分地区的猪流感病毒进行分离鉴定后,首次证实河南省猪群中存在H1N2猪流感病毒,通过病毒分离株全基因组序列的测定和遗传演化分析显示所分离到的三个H1N2猪流感病毒毒株均为新型四源重组猪流感病毒,两株H1N1猪流感病毒毒株为H1N1亚型,属于经典猪流感谱系.本研究系统阐述了河南地区H1N2亚型和H1N1亚型分离株的遗传演化数据,对河南省乃至华北地区SIV流行病学、病原学和遗传演化特征的分析具有十分重要的经济意义和公共卫生学意义.