论文部分内容阅读
目的:探讨独活寄生汤抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应的作用机制方法:4周龄SD大鼠取膝关节软骨,超净台内分离软骨细胞进行体外培养,镜下观察软骨细胞形态,并使用Ⅱ型胶原免疫组化法对所提取的软骨细胞进行鉴定。脂多糖诱导软骨细胞,建立软骨细胞炎症模型,酶联免疫吸附法检测软骨细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)9含量确定独活寄生汤最佳干预浓度后,取对数期生长的第2代软骨细胞随机分为空白对照组、模型组(LPS10ng/ml)、独活寄生汤组(LPS 10ng/ml+独活寄生汤300μg/ml)、抑制剂组(LPS 10ng/ml+PDTC10μmol),4组均连续干预培养8 h,采用荧光定量RT-PCR法检测软骨细胞中信号通路相关基因表达水平,采用Western blot法检测软骨细胞中核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、NF-κB抑制物的激酶(inhibitor of NF-κB kinases, IKKs)-β、 II型胶原(Collagen II)的蛋白表达量,采用免疫荧光检测法检测软骨细胞中NF-κB的蛋白表达量。结果:(1)软骨细胞免疫组化鉴定结果第2代软骨细胞胞浆及细胞膜呈棕黄色阳性染色,具有典型的软骨细胞生物学特征。(2)各组软骨细胞培养液中MMP9含量的比较各组软骨细胞培养液MMP9含量的比较,差异有统计学意义(0.125±0.012,0.154±0.008,0.148±0.012,0.148±0.010,0.134±0.002,c2=10.034,P=0.040),当独活寄生汤浓度为300μg/ml,MMP-9表达显著低于模型组,差异具有统计学意义(F=6.324,P=0.008)。(3)软骨细胞中NF-κB信号通路相关基因的表达各组干预8 h后,空白对照组、模型组、独活寄生汤组、抑制剂组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、IKK-α基因表达量比较,组间差异有统计学意义。模型组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、IKK-α基因表达量均高于空白组(LSD-t=5.034,P=0.000;LSD-t=10.490,P=0.000;LSD-t=8.062,P=0.000;LSD-t=6.169,P=0.000);独活寄生汤组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、IKK-α基因表达量均低于模型组(LSD-t=-2.378,P=0.035;LSD-t=-3.918,P=0.004;LSD-t=-4.102,P=0.003);空白组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、IKK-α基因表达量与独活寄生汤组相比,IKK-α基因表达量差异无统计学意义(LSD-t=-2.655,P=0.021;LSD-t=-6.572,P=0.000;LSD-t=-2.067,P=0.073);抑制剂组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、IKK-α基因表达量均低于模型组(LSD-t=-3.369,P=0.006;LSD-t=-7.664,P=0.000;LSD-t=-3.230,P=0.012);独活寄生汤组软骨细胞中NF-κB、IKK-α基因表达量与抑制剂组相比,差异无统计学意义(LSD-t=0.991,P=0.341;LSD-t=-3.230,P=0.409),抑制剂组IKK-β基因表达量低于独活寄生汤组(LSD-t=3.745,P=0.006)。(4)软骨细胞中NF-κB、IKK-β、Collagen II的蛋白表达各组分别干预8h后,空白组、模型组、独活寄生汤组、抑制剂组中软骨细胞中NF-κB、IKK-β、Collagen II蛋白表达量比较,组间差异有统计学意义。模型组软骨细胞中NF-κB、IKK-β蛋白表达量均高于空白组(LSD-t=7.902,P=0.000;LSD-t=2.537,P=0.035),Collagen II蛋白表达量低于空白组(LSD-t=-6.128,P=0.000);独活寄生汤组软骨细胞中NF-κB、IKK-β蛋白表达量低于模型组(LSD-t=6.363,P=0.000;LSD-t=3.392,P=0.009),Collagen II蛋白表达量高于模型组(LSD-t=3.536,P=0.008);空白组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、Collagen II蛋白表达量与独活寄生汤组比较,NF-κB、IKK-β蛋白表达量,差异无统计学意义(LSD-t=-1.539,P=0.162;LSD-t=0.856,P=0.417;LSD-t=2.593,P=0.032);抑制剂组软骨细胞中NF-κB、IKK-β、Collagen II蛋白表达量与独活寄生汤组比,差异无统计学意义(LSD-t=-1.952,P=0.087;LSD-t=-1.146,P=0.285;LSD-t=-1.414,P=0.195)。(5)软骨细胞中NF-κB蛋白定位检测结果。各组分别干预8h后,双转盘显微镜观察可见软骨细胞细胞核呈蓝色;NF-κB蛋白染色明显,呈绿色,主要分布于细胞胞浆,部分进入细胞核。同时模型组的软骨细胞核转位最为明显,表达量最多,空白组、抑制剂组核软骨细胞转位情况相对较少,独活寄生汤组软骨细胞的核转位情况位于正常组与模型组之间。结论:独活寄生汤可以抑制脂多糖诱导的软骨细胞炎症反应。