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第一部分POSH在颞叶癫痫患者及其动物模型脑组织中的表达目的:检测POSH在难治性颞叶癫痫(TLE)患者术后脑组织及癫痫小鼠模型脑组织中的表达情况,以明确POSH是否可能与TLE存在相关性。方法:1.从课題组已建立的包含了300多例难治性TLE患者术后脑组织和100多例脑外伤减压术中切除的正常颞叶脑组织的脑库中,随机选取癫痫脑组织标本20例和正常脑组织标本12例。2.16只成年雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g),随机分为两组,一组采用海马内立体定向注射海人酸构建慢性TLE动物模型,另一组仅注射溶剂作为对照,30天后获取海马和皮质脑组织。3.采用免疫印迹法检测POSH的表达水平,免疫荧光三标法检测POSH的表达部位。结果:1.免疫印迹结果显示,在难治性TLE患者术后脑组织中,POSH的表达水平较对照组的正常颞叶脑组织显著升高(p<0.05)。2.在海人酸诱导的小鼠慢性TLE模型中,小鼠颞叶皮质和海马组织内POSH的表达水平较正常对照组小鼠显著升高(p<0.01)。3.免疫荧光三标法检测结果显示,在难治性TLE患者的颞叶脑组织和海人酸模型脑组织中,POSH免疫荧光均与神经元标志物MAP2的免疫荧光存在共表达,而与星状胶质细胞标记物GFAP的荧光没有共表达。结论:POSH表达在神经元上,TLE患者和动物模型脑组织中POSH的表达均显著升高,提示POSH可能参与了癫痫的发生发展。第二部分POSH对海人酸模型癫痫发作的影响目的:为进一步探讨POSH在TLE发生发展中的作用,我们分别构建了过表达POSH基因和携带POSH-shRNA的慢病毒载体及各自的对照病毒,采用海马内立体定向注射的方法升高或降低海马内POSH蛋白的表达水平,观察POSH表达水平的变化对海人酸模型癫痫发作的影响。方法:1.海马内立体定向注射POSH过表达慢病毒或POSH-sh RNA慢病毒及各自的对照病毒:成年雄性C57BL/6小鼠(体重20-25g),随机分为四组,分别向海马内注射携带绿荧光蛋白(GFP)的POSH过表达病毒(POSH-LV组)、过表达对照病毒(CON-LV组)、POSH-shRNA慢病毒(POSH-shRNA组)及对照shRNA慢病毒(CON-shRNA组)。2.在注射病毒后14天和30天分别处死4只小鼠,通过检测海马内的免疫荧光和免疫印迹法检测POSH的表达情况来验证慢病毒的效率。3.海人酸模型行为学监测及场电位记录:动物在注射以上慢病毒2周后(每组10只),向小鼠海马内注射海人酸(200ng)诱导慢性TLE模型,持续视频监测动物的癫痫发作情况,30天后进行海马内局部场电位记录。结果:1.各组海马内立体定向注射慢病毒后,免疫荧光结果显示海马内,尤其是CA1区,有明显的GFP绿荧光表达。免疫印迹结果显示,在注射慢病毒后第14天和第30天,POSH-LV组海马内POSH蛋白的表达较CON-LV组显著升高(p<0.01),而POSH-sh RNA组POSH蛋白的表达较CON-shRNA组显著降低(p<0.01)。2.注射海人酸造模后观察动物行为学发现,POSH-LV组小鼠出现首次癫痫发作的潜伏期较CON-LV组显著缩短(p<0.05),而发作频率较CON-LV组显著增加(p<0.01);而POSH-shRNA组与CON-shRNA组相比,首次发作潜伏期明显延长(p<0.05),发作频率明显减少(p<0.01)。局部场电位记录发现,与各自的对照组相比,POSH-LV组30分钟内癫痫样放电(EDs)的次数和总时间较对照组显著增加(p<0.05),而POSH-shRNA组较对照组显著降低(p<0.05)。结论:通过海人酸慢性TLE模型证实,在癫痫发生发展过程中,干预POSH可影响癫痫发作,过表达POSH使癫痫发作活性加重,而抑制POSH使癫痫发作活性减轻,提示POSH促进癫痫的发生发展。第三部分POSH影响癫痫发作的电生理机制目的:采用全细胞膜片钳技术,从电生理角度探讨POSH影响癫痫发作的可能机制。方法:1.取20只成年雄性C57BL/6小鼠,随机分为四组,分别向海马内注射POSH过表达病毒(POSH-LV组)、过表达对照病毒(CON-LV组)、POSH-shRNA慢病毒(POSH-shRNA组)及对照shRNA慢病毒(CON-shRNA组)。2.注射慢病毒后2周制备小鼠海马脑片,利用全细胞膜片钳技术记录海马CA1区锥体神经元的神经电生理,包括动作电位(AP),微小抑制性突触后电流(mIPSCs),微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)、诱发的兴奋性突触后电流(eEPSCs)。比较各组AP、mIPSCs、mEPSCs及AMPA receptor/NMDA receptor介导的eEPSCs的变化。结果:1.全细胞膜片钳结果显示,POSH-LV组海马脑片AP的发放频率较CON-LV组明显增加(p<0.05),而POSH-shRNA组AP发放频率较CON-shRNA组明显降低(p<0.01)。2.POSH-LV组和POSH-shRNA组mIPSCs频率和幅值较相应的对照组均无明显变化。3.POSH-LV组和POSH-shRNA组mEPSCs的频率较相应的对照组均无明显变化;POSH-LV组mEPSCs的幅值较CON-LV组明显升高(p<0.05),而POSH-shRNA组较CON-shRNA组明显降低(p<0.01)。4.eEPSCs记录结果显示,POSH-LV组和POSH-shRNA组的AMPA受体介导的eEPSCs的幅值较其对照组均无明显变化,而POSH-LV组NMDA受体介导的eEPSCs的幅值较CON-LV组明显升高(p<0.01),而POSH-shRNA组较CON-shRNA组明显降低(p<0.01)。结论:过表达POSH增加NMDA受体介导的兴奋性突触后传递、增加神经元兴奋性,而敲低POSH降低NMDA受体介导的兴奋性突触后传递、降低神经元兴奋性。第四部分POSH影响癫痫发作的靶点机制目的:通过了解POSH对NMDA受体的调节作用,以探讨POSH参与癫痫发作的靶点机制。方法:1.免疫共沉淀检测POSH与NMDA受体亚单位NR1的相互作用。2.在动物实验后的脑组织中,采用免疫印迹法检测NMDA受体亚单位NR1的总蛋白和膜蛋白的表达变化。结果:1.免疫共沉淀实验结果显示POSH与NR1能够互相沉淀。2.免疫印迹结果显示,各组NR1总蛋白的表达无明显差异;POSH-LV组膜上NR1的表达较CON-LV组明显增加(p<0.05);而POSH-sh RNA组膜上NR1的表达较CON-shRNA组明显降低(p<0.05)。结论:POSH能与NR1相互作用,它不影响NR1总量的表达,但是可以增加NMDA受体在神经细胞膜上的表达。