目的：通过构建高拷贝数表达质粒获得稳定高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法：通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5AOX.HBsAg-TT)重复导入载体,构建成高拷贝数表达质粒。通过电转化、l5L规模发酵、纯化获得纯化HBsA9颗粒,经ELISA、Western blot、SDS-PAGE、电镜、免疫学试验等方法对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行了研究。结果：高拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot等试验,显示出特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制剂能有效刺激小鼠产生保护抗体。结论：构建含高拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。此为获取低成本免疫用HBsAg提供了一条新的途径。