第一部分:尿酸排泄不良型高尿酸血症大鼠动物模型的建立目的:高尿酸血症动物模型的造模方法有很多,但不外乎三种造模原理:1.增加尿酸的摄入及促进尿酸生成;2.抑制或消除尿酸酶活性,减少尿酸分解;3.抑制尿酸排泄。而临床上根据血尿酸水平和尿尿酸排泄情况,将高尿酸血症分为以下三型[1]:(1)尿酸排泄不良型;(2)尿酸生成过多型;(3)混合型。临床研究结果表明90%的原发性高尿酸血症属于尿酸排泄不良型[2],且大多数高尿酸血症患者很长一段时间内没有明显的肝功能和肾功能异常表现。因此建立与临床高尿酸血症分型相匹配的尿酸排泄不良型高尿酸血症动物模型具有重大意义。人类在进化过程中淘汰了尿酸分解代谢的重要酶—尿酸氧化酶,导致尿酸成为了嘌呤代谢的终产物,因此尿酸酶抑制剂的应用是消除人类与啮齿类高尿酸血症动物模型的方法之一。吡嗪酰胺[3]和乙胺丁醇均为抗结核药物,都能抑制肾脏对尿酸的排泄。本实验使用尿酸酶抑制剂氧嗪酸钾联合抑制肾脏排泄尿酸的药物吡嗪酰胺或者乙胺丁醇,以期建立更为理想的、与人类临床尿酸排泄不良型高尿酸血症更为接近的大鼠动物模型,并对比两种方法的优劣,为优化并规范此类模型的建立方法奠定基础。材料与方法:将30只雄性SD大鼠随机分为空白对照组(简称空白组)、氧嗪酸钾+乙胺丁醇组(简称模型Ⅰ组)、氧嗪酸钾+吡嗪酰胺组(简称模型Ⅱ组),分别给予0.9%的氯化钠溶液、氧嗪酸钾300mg/kg+乙胺丁醇250mg/kg、氧嗪酸钾300mg/kg+吡嗪酰胺300mg/kg进行模型的建立。分别于实验前、实验1w、实验3w、实验5w球后静脉采血,并收集24h尿液及粪便,处死后摘取部分肝脏组织和左侧部分肾脏组织。采用手工法(比色法)检测血清尿酸、尿尿酸、粪便尿酸、肝功能和肾功能,并对肝脏和肾脏组织行病理切片,观察其组织病理学变化。结果:与空白对照组比较,在实验1w后,模型Ⅰ组和模型Ⅱ组大鼠血清尿酸水平均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在实验3w、实验5w时,模型Ⅰ组血清尿酸含量持续下降,与实验1w时比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型Ⅱ组在整个实验期间血清尿酸含量保持在同一高水平,与实验1w时比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组大鼠肝功能和肾功能检测结果与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。肝脏及肾脏病理切片观察结果显示,两模型组与空白对照组比较,未见明显异常,与血液检测结果相符。结论:氧嗪酸钾+乙胺丁醇及氧嗪酸钾+吡嗪酰胺两种造模方法均能有效建立尿酸排泄不良型高尿酸血症大鼠动物模型。而应用氧嗪酸钾联合吡嗪酰胺的方法建立的动物模型,其血清尿酸稳定性更好,在建模原理上符合人类尿酸排泄不良型高尿酸血症的发病机制,因此更适合用于高尿酸血症治疗药物的长期应用观察。第二部分:降尿酸方治疗尿酸排泄不良型高尿酸血症的实验研究目的:高尿酸血症对人类健康存在巨大的威胁,因此人们对高尿酸血症的研究给予了更多的关注。目前临床上用于治疗高尿酸血症的西药主要有三大类:1.抑制尿酸生成的药物,主要是黄嘌呤氧化酶抑制剂(XO抑制剂),包括别嘌呤醇(Allopurinol)以及非布司他(Febuxostat);2.促进尿酸排泄的药物,主要是针对尿酸盐阴离子转运蛋白1(URAT1)的抑制剂,包括苯溴马隆和丙磺舒;3.尿酸氧化酶,主要包括拉布立酶和培戈洛酶,但目前都未获批在中国上市。临床上运用中医中药治疗高尿酸血症的病例数不胜数,文献中也有许多相关报道,包括中药有效成分、单味中药和中药复方等。降尿酸方是于世家教授临床应用治疗高尿酸血症的经验之精华,临床疗效明确。本文在成功建立尿酸排泄不良型高尿酸血症大鼠动物模型的基础上,应用降尿酸方进行干预。观察降尿酸方对本模型的疗效是否具有量效关系,以明确药物的最佳剂量。同时,与具有明确治疗作用的西药苯溴马隆作以对比,观察两者在降尿酸作用上、对血脂的调节上以及对肝功能和肾功能的影响上有何异同。材料与方法:实验前,先随机抽取10只健康雄性SD大鼠作为空白对照组,然后应用成功的建模方法:多点皮下注射氧嗪酸钾300mg/kg+腹腔注射吡嗪酰胺300mg/kg进行模型的建立。一周后,将成模的大鼠随机分为中药低剂量组(简称中低组)、中药中剂量组(简称中中组)、中药高剂量组(简称中高组)、苯溴马隆组(简称西药组)、模型组,分别灌胃给予中药25g/kg、中药50g/kg、中药100g/kg、苯溴马隆4.5mg/kg和0.9%的氯化钠溶液,连续给药4周。分别于实验前、实验1w、实验3w、实验5w球后静脉采血,上代谢笼收集24h尿液及粪便,麻醉处死动物后摘取部分肝脏、左侧部分肾脏、部分小肠。采用手工法(比色法)检测血清尿酸、尿尿酸、粪便尿酸、血脂、肝功能和肾功能,并对其肝脏和肾脏组织行病理切片。结果:1.实验1w时,与空白组比较,各组大鼠血清尿酸水平均升高(P<0.01),但各组之间比较差异无统计学意义(P>0.05);实验3w和实验5w时,与模型组比较,各给药组血清尿酸含量均降低(P<0.05),其中中低组大鼠血清尿酸含量与中中组、中高组、西药组相比,差异有统计学意义(P<0.05),而中中组、中高组和西药组两两比较,血清尿酸含量接近,差异无统计学意义(P>0.05)。2.实验5w时,与空白对照组比较,模型组与西药组TG、TC、LDL-C的水平均增加,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组和西药组比较,血脂水平差异无统计学意义(P>0.05),中中组和中高组TC、TG及LDL-C水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05);中中组与中高组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。整个实验过程,HDL-C的变化不大,差异无统计学意义(P>0.05)。3.与空白对照组比较,各组大鼠肝功能和肾功能检测结果无显著性差异(P>0.05)。肝脏及肾脏组织病理切片观察也未见明显异常。结论:降尿酸方对尿酸排泄不良型高尿酸血症大鼠动物模型的疗效具有量效关系,但不明显。中药中剂量组、中药高剂量组及西药苯溴马隆组降低血清尿酸的力度相当。中药组随着计量的增加调节血脂的能力增强,而西药组对血脂的影响不明显。各实验组均未见明显的肝脏和肾脏损害。第三部分:降尿酸方治疗尿酸排泄不良型高尿酸血症疗效机制的研究目的:不同的抗高尿酸血症药物,虽然都可以降低血清尿酸水平,但降尿酸的作用靶点不尽相同,降尿酸的作用大小亦有强有弱。其中,别嘌呤醇和非布司他主要是通过抑制肝脏中尿酸生成的重要酶—黄嘌呤氧化酶的活性,从而减少尿酸的生成,降低血清尿酸水平。而苯溴马隆和丙磺舒则是通过抑制尿酸在肾脏的主要转运体—尿酸阴离子转运蛋白1(URAT1)的表达,减少肾脏对尿酸的重吸收,从而促进尿酸在肾脏的排泄,降低血清尿酸水平。尿酸氧化酶是一种可以直接将尿酸氧化并分解为尿囊素的酶,而尿囊素是一种惰性和水溶性嘌呤代谢物,易于经肾脏排泄,因此尿酸氧化酶也可降低体内的血尿酸水平。单味中药降尿酸的作用有抑制尿酸生成的,也有促进尿酸排泄的。如萆薢总皂苷[4]可以通过下调URAT1的表达,上调OAT1、OAT3的表达抑制尿酸在肾脏的重吸收过程,促进尿酸在肾脏的排泄过程,从而降低血清尿酸含量。中药复方因其成分多样,作用靶点也是多个的,加之配伍合理,中药复方的降尿酸效果应该更好,更有可能成为强有力的治疗高尿酸血症的武器。本文通过检测大鼠肝脏XO活性,肾脏GLUT-9、ABCG2、URAT1及肠道ABCG2 m RNA的表达情况,探讨降尿酸方对尿酸排泄不良型高尿酸血症疗效的可能机制,为今后开发多靶点的新型治疗药物提供理论支持。材料与方法:实验动物分组及干预方法同第二部分,应用Western-Blot技术检测大鼠肝脏组织中黄嘌呤氧化酶的活性;应用RT-PCR技术检测左侧肾脏组织中GLUT-9、ABCG2、URAT1m RNA的表达情况;应用RT-PCR技术检测肠道组织中ABCG2 m RNA的表达情况,探讨降尿酸方对尿酸排泄不良型高尿酸血症疗效的可能机制。结果:1.Western-Blot法测定肝脏黄嘌呤氧化酶活性结果:与空白组比较,模型组XO表达稍有减少,西药组无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05);中药各剂量组XO表达均有减少(P<0.05),且随着剂量的增加,下调程度增强。但中中组和中高组差异无统计学意义(P>0.05)。2.RT-PCR法测定结果:⑴肾脏尿酸盐转运体URAT1 m RNA的表达:与空白对照组相比,中药各计量组及西药组均出现下调变化,除中低组外差异均有统计学意义(P<0.05),其中西药组下调幅度最大,有显著性差异(P<0.01)。与中低组比较,中中组和中高组下调差异相似,差异有统计学意义(P<0.05)。与西药组比较,中高组与之相当,下调差异无统计学意义(P>0.05)。而模型组明显上调其表达,差异显著(P<0.01);(2)肾脏葡萄糖转运体GLUT9m RNA的表达情况:与空白对照组相比,模型组无变化(P>0.05),中药各计量组及西药组均出现下调变化,除中低组外差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,西药组、中中组和中高组下调差异显著(P<0.01)。而西药组、中中组和中高组组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);(3)对于在肾脏和肠道中三磷酸腺苷结合转运蛋白ABCG2 m RNA的表达情况:与空白对照组比较,西药组和模型组均无明显变化(P>0.05),与西药组比较,中药各计量组均出现不同程度的上调,且中中组和中高组ABCG2上调差异显著(P<0.01),中低组虽然也有上调趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:降尿酸方通过抑制肝脏XO活性以减少尿酸的生成,通过下调肾脏URAT1、GLUT-9 m RNA的表达,减少肾脏对尿酸的重吸收,通过上调肾脏及肠道的ABCG2 m RNA的表达,促进尿酸在肾脏和肠道的排泄,从而降低血尿酸水平。降尿酸方是一个多作用靶点、多作用通道的降尿酸药物。