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目的:构建不同时间段STZ诱导的DM大鼠动物模型。通过激活或失活SOCCs通道,运用离体逼尿肌肌条收缩实验来研究SOCCs在DCP疾病中对膀胱肌条收缩功能的作用。通过原代逼尿肌细胞分离培养,培养出原代逼尿肌细胞。采用SOCCs的激活剂和抑制剂,研究激活或失活该通道后,DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度的变化。并研究不同糖尿病病程作用下,大鼠膀胱中SOCCs关键分子STIM1和Orai1的m RNA水平和蛋白水平表达的改变情况。方法:1.6-8周雌性S-D大鼠70只,按年龄分为每组10只,其中正常对照组(normal control,N组)4组,实验组(diabetes mellitus,DM组)3组。DM组:单次腹腔注射p H4.5,0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液溶解的链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),50mg/kg。N组:单次腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。具体分组:DM组:(1)4周实验组(DM4W组):注射STZ,成模后4周处死。(2)8周实验组(DM8W):注射STZ,成模后8周处死。(3)12周实验组(DM12W):注射STZ,成模后12周处死。N组:(1)0周对照组(N0):注射缓冲液后3天后处死。(2)4周对照组(N1):注射缓冲液后4周后处死。(3)8周对照组(N2):注射缓冲液后8周后处死。(4)12周对照组(N3):注射缓冲液后12周后处死。注射药物3天后测量随机血糖三次,血糖值均大于16.7mmol/L,认为DM模型构建成功。其后观察处死时血糖,大鼠体重等指标变化,并留取膀胱组织进行HE染色,评估膀胱组织学改变。2.分别制备8*3*3mm离体逼尿肌肌条,解剖显微镜下去除膀胱粘膜及浆膜层,置于kreb’s液中,通过给予环匹阿尼酸(cyclopiazonic Acid,CPA)激活SOCCs和SKF-96365抑制SOCCs来观察各组离体逼尿肌肌条收缩频率和收缩幅度的变化。3.采用酶消化法来分离逼尿肌细胞进行原代细胞培养。具体使用胶原蛋白酶Ⅱ4mg/ml及牛血清白蛋白(BSA)4mg/ml,在37℃,5%CO2的条件下消化40-60分钟。观察所获得细胞形态、生长方式及α-SMA免疫荧光法检测平滑肌细胞特异性。4.分离培养24h的原代逼尿肌细胞负载Fluo-4AM,通过激活和失活SOCCs通道,在激光共聚焦显微镜下观察和记录各组逼尿肌细胞荧光强度的变化,最后计算实测荧光强度(F1)比背景荧光强度(F0)的变化,即采用F1/F0来进行比较在SOCCs激活和失活后,各组细胞钙离子的变化。5.RT-q PCR法和Western Blot法测定不同时间DM大鼠膀胱组织STIM1和Orai1分子的表达水平。结果:1.DM组大鼠血糖均大于16.7mmol/l,体重连续降低,与对照组对比,DM组大鼠体重下降具有统计学意义(p<0.05),膀胱扩张明显,可见膀胱尿潴留,血糖也明显增高(p<0.05)。HE染色提示随着糖尿病进展,DM组逼尿肌细胞增生,肥大,纤维组织排列紊乱,间质疏松。2.加入CPA和SKF-96365后离体膀胱逼尿肌肌条收缩频率变化:加入CPA后,所有实验组肌条收缩频率均增加。与对照组比较,DM4W组和DM8W组肌条收缩频率明显增加(DM4W vs N1:t=3.776,p=0.002;DM8W vs N2:t=2.282,p=0.039)。DM三组实验组之间比较,DM4W组与DM12W,DM8W组与DM12W,均表现为收缩频率增强(DM12W vs DM4W,p=0.039;DM12W vs DM8W,p=0.012),各个时间正常组间比较,无统计学意义。加入SKF-96365后,所有实验组肌条收缩频率降低。与对照组比较,DM4W和DM8W组肌条收缩频率仍较高(DM4W vs N1:t=-3.750,p=0.02;DM8W vs N2:t=-2.593,p=0.021)DM三组之间比较,DM12W组较其他两组明显高(DM12W vs DM4W,p=0.004;DM12W vs DM8W,p=0.021),具有统计学意义,各个时间正常组间比较,无统计学意义。3.加入CPA和SKF-96365后离体膀胱逼尿肌肌条收缩幅度变化:在所有实验组中加入CPA后,逼尿肌肌条收缩幅度均下降;在加入SKF-96365后,收缩幅度均有所回升,但仍小于没加药前。各组之间逼尿肌肌条收缩幅度比较,差异不明显,没有统计学意义。4.成功分离培养出膀胱逼尿肌细胞,细胞3-5天逐渐融合显片状生长,7天左右平滑肌融合达到80%以上。细胞呈平滑肌细胞典型的“峰-谷”样生长,α-SMA免疫荧染色阳性。5.加入CPA后,激活SOCCs,所有实验组逼尿肌细胞相对荧光强度均增加,DM4W、DM8W与对照组比较相对荧光强度显著增强(DM4W vs N1:t=4.867,p=0.0002;DM8W vs N2:t=4.203,p=0.001),DM组之间比较,DM12W较其他两组明显降低(DM12W vs DM4W,p=0.001;DM12W vs DM8W,p=0.0004,DM8W vs DM4W,p=0.680),具有统计学意义。加入SKF-96365后,SOCCs失活,细胞相对荧光强度降低,与对照组比较DM4W,DM8W的荧光相对强度仍显著高于对照组(DM4W vs N1:t=3.141,p=0.007;DM8W vs N2:t=3.871,p=0.002),DM组之间比较,DM12W较其他两组明显降低(DM12W vs DM4W,p=0.003;DM12W vs DM8W,p=0.002,DM8W vs DM4W,p=0.914)。6.在DM4W和DM8W组中,与对照组比较,Orai1m RNA和蛋白表达量显著增加(m RNA:DM4W vs N1:t=6.049,p=0.0001;DM8W vs N2:t=4.122,p=0.002蛋白:DM4W vs N1:t=8.862,p=0.001;DM8W vs N2:t=10.803,p=0.0004)。STIM1m RNA表达量在DM4W组中显著增加(t=2.799,p=0.019),STIM1蛋白表达量在DM4W和DM8W组中显著增加(DM4W vs N1:t=6.540,p=0.003;DM8W vs N2:t=3.495)。DCP不同时间比较,Orai1m RNA的表达量在DM12W组中与其他DM组比较明显降低(DM12W vs DM4W,p=0.0001;DM12W vs DM8W,p=0.001,DM8W vs DM4W,p=0.329);Orai1蛋白表达量也明显降低(DM12W vs DM4W,p=0.007;DM12W vs DM8W,p=0.011,DM8W vs DM4W,p=0.717)。STIM1m RNA的表达量在DM4W组中较其他DM组明显增加(DM4W vs DM8W,p=0.013;DM4W vs DM12W,p=0.002,DM8W vs DM12W,p=0.409),而STIM1蛋白表达量在DM三组间均不同(DM12W vs DM4W,p=0.0003;DM12W vs DM8W,p=0.003,DM8W vs DM4W,p=0.046)。结论:1.成功建立SZT诱导的DM大鼠模型。在DCP疾病中,SOCCs参与调节了膀胱逼尿肌的收缩功能,SOCCs对膀胱逼尿肌收缩频率调节作用增强。2.采用酶消化法成功分离培养了膀胱逼尿肌细胞,SOCCs参与了DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度的调节。随着DCP病程进展,SOCCs对膀胱逼尿肌细胞钙离子调节作用先增强(4、8周)后减弱(12周)。3.在DCP疾病4周时,Orai1和STIM1表达增强,糖尿病影响了大鼠膀胱SOCCs关键分子Orai1和STIM1的表达水平。