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目的:克隆合浦珠母贝GIP结合蛋白亚基,并对其序列及表达分布进行研究。
方法:利用RNAzol从合浦珠母贝外套膜组织中提取总RNA,OligodT作引物进行反转录合成cDNA,并根据不同物种间氨基酸保守区设计简并引物,采用PCR的方法,从cDNA中扩增出目的基因约500bp,将所得基因片段与T载体连接,转化到JM109宿主菌中,挑选阳性克隆,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。分别提取合浦珠母贝外套膜、闭壳肌、生殖腺、腮腺和内脏断组织中的总RNA,并转印至尼龙膜上,利用α-P-dCTP随机引物标记基因探针,进行Northern Blot;同时利用地高辛随机引物标记基因探针,进行组织切片的原位杂交。
结果:克隆出的α亚基片段在GetBank中进行同源搜索,其氨基酸序列与章鱼、蜗牛的a亚基同源性为82%。Northern Blot.结果表明,α亚基在各种组织中的表达分布,由强到弱依次为腮腺、外套膜、生殖腺、闭壳肌和内脏团。
结论:本研究首次报道在合浦珠母贝GIP结合蛋白α亚基基因片段,为进一步研究合浦珠母贝G蛋白介导的信号转导途径及其对生物矿化的调节作用打下了基础。