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目的:最近在脑外伤动物模型中发现溶酶体蛋白酶抑制剂CBI能够减轻外伤性脑兴奋毒性损伤。本研究在前期工作基础上继续探讨CBI在三氟乙醚敏新生期大鼠反复惊厥性脑损伤中的干预作用及其信号通路,为临床干预提供依据。
方法:90只生后6d(用P6表示,下同)的健康Sprague—Dawley(SD)大鼠随机分为三组,每组30只:对照组、反复惊厥组及CBI组。反复惊厥组(用RS表示,下同)每日吸入三氟乙醚诱导惊厥发作5次,每次间隔30min。连续9天;对照组同样操作但不吸入三氟乙醚;CBI组于惊厥前腹腔注射cathepsin B(2μl,0.5 g/μl),同样方法吸入三氟乙醚诱导惊厥发作。各组分别于末次惊厥后1.5h、3h、6h、24h四个时间点(n=6/每点/每组)取海马及大脑皮层组织,采用免疫印迹技术(Western blot)检测自噬标记蛋白LC3和Beclinl的表达及可塑性相关基因-1(PRG—1)的表达;分别于生后6 d~15 d通过平面翻正试验,悬崖回避试验,空中翻正反射试验评价其神经行为发育,1月龄时行Morris水迷宫行为以及旷场实验,检测认知功能及探索行为,实验结束取其海马及大脑皮层组织,免疫印迹检测LC3、Beclinl及PBG-1的表达。
结果:免疫印迹法显示:(1)RS组于末次惊厥后1.5h、3h、6h、24h海马及大脑皮层LC3II/LC3I比值及Bedinl的表达较对照组显著升高(P<0.05);CBI组较RS组LC3-II/IC3-I比值及Bedinl水平显著降低(P<0.05)。(2)RS组于末次惊厥后1.5h、3h、6h、24h海马及大脑皮层PRG-1的值较对照组无明显差异(P>0.05);CBI组PRG-1的值与RS组比较亦无明显差异(P>0.05)。(3)RS组于行为能力测定之后海马及大脑皮层LC3II/LC3I比值及Beclinl的表达较对照组无统计学差异(P>0.05);CBI组与RS组比亦无明显差异(P>0.05)。(4)RS组于行为能力测定之后海马及大脑皮层PRG-1蛋白水平较对照组显著增高(P<0.01);CBI组与RS组比较PRG-1的值显著降低(P<0.05)。行为学结果示:(1)神经发育指标:<1>RS组悬崖回避时间较对照组和CBi组有明显延迟(P<0.01),提示RS组神经反射发育延迟。(2)Morris水迷宫实验显示:RS组逃避潜伏期较对照组和CBI组显著延长(P<0.01),CBI组与对照组无统计学意义。(3)旷场行为测试:水平运动RS组较对照组明显减少(P<0.05),CBI组较RS组无差异;垂直运动RS组较对照组显著减少(P<0.01),CBI组较RS组明显增多(P<0.05)。
结论:⑴新生期三氟乙醚诱导反复惊厥使早期海马及大脑皮层自噬标记蛋白LC3、Bedim表达明显上调,自噬激活;同时造成远期学习能力损害和神经行为发育异常。并可能与前脑PRG—1表达上调有关。⑵惊厥发作前应μ用自噬抑制剂CBI能显著抑制惊厥所致海马及大脑皮层LC3、Bedinl的表达,减轻惊厥所致的远期学习能力损害和神经行为损伤,并下调前脑PRG—1表达。⑶本研究表明。CBI能够通过自噬信号途径抑制发育期惊厥所致远期脑损伤及基因表达异常。