【摘 要】
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目的 类风湿关节炎(RA)作为自身免疫性疾病至今病因不明,人类白细胞抗原(HLA) DR抗原β链第70～74位氨基酸残基的多态性与RA的易感性有密切的关系,该段位置上的氨基酸序列为QKRAA、QRRAA或RRRAA的个体,都表现出对RA的易感性增高,其中QRRAA多见于亚洲人种.而DERAA为RA保护性序列.本研究旨在探索共同表位(shared epitope,SE) QRRAA与DERAA的亲和
【机 构】
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南方医科大学珠江医院风湿免疫科 广州 510282
【出 处】
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全国第十二届中西医结合风湿病学术会议
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目的 类风湿关节炎(RA)作为自身免疫性疾病至今病因不明,人类白细胞抗原(HLA) DR抗原β链第70～74位氨基酸残基的多态性与RA的易感性有密切的关系,该段位置上的氨基酸序列为QKRAA、QRRAA或RRRAA的个体,都表现出对RA的易感性增高,其中QRRAA多见于亚洲人种.而DERAA为RA保护性序列.本研究旨在探索共同表位(shared epitope,SE) QRRAA与DERAA的亲和肽特征、核心序列以及同源性性分析,以期发现RA发病相关抗原,为进一步研究RA发病机制提供新的线索.方法 采用噬菌体呈现技术,Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit (New England Biolabs)试剂盒由2×1013pfu/ml,复杂度～2.8×109个转化子十二肽库,和-28 gⅢ测序引物：5-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3,-96 gⅢ测序引物：5-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3,以及E.coli ER2738宿主菌1.5mg链霉亲和素,10mM生物素等组成.经4轮包被、结合、洗脱,获取并测定少量(1μl)洗脱物的滴度,接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中,摇床培养至对数中期(0 D600～0.5).获得每10 μ 1噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度.噬菌斑经扩增测序并使用DNA-star软件推导外源十二肽的氨基酸序列.由NCBI网站的BLAST软件完成(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)完成序列同源性分析.以上过程重复4次.结果 以QRRAA、DERAA、链霉亲和素和胸腺肽五肽等4种多肽溶液为靶分子,对噬菌体肽库进行4轮筛选,胸腺肽五肽为阴性对照组,链霉亲和素为阳性对照组.第一,第二轮淘选采用酸洗脱,第三轮淘选采用靶分子特异性洗脱.结果显示,随着筛选轮次的增加,从固相平板洗脱的噬菌体数呈明显的增加趋势,回收率(回收/投入噬菌体量)逐轮升高并趋于稳定,说明每轮筛选后与靶分子结合的噬菌体得到有效富集.第2轮筛选后与第1轮相比,富集了212倍(富集倍数=第3轮回收率/第1轮回收率),见表-1.竞争结合和实验确认亲和性.综合三次的淘选结果,靶分子DERAA在三次中均出现的序列为HWH核心序列,靶分子QRRAA在三次实验中均出现的序列为WPS核心序列.所测的2个靶分子的结合序列一致,都为WPSHWHGRGTAV,但是测得的结合序列在总序列中所占比例不一样,QRRAA测得的结合序列WPSHWHGRGTAV所占比例为27.08％,而DERAA测得的结合序列WPSHWHGRGTAV所占比例为70.83％.这个比例在一定程度上反应了靶分子与结合序列WPSHWHGRGTAV的相互作用的强弱.因此我们推测DERAA与WPSHWHGRGTAV相互作用较QRRAA与WPSHWHGRGTAV相互作用强.结合本课题的文献,正常人是DERAA,而DERAA突变成QRRAA,人得关节炎疾病几率大增.因此我们推断DERAA突变成QRRAA,与所携带WPSHWHGRGTAV(关键域PSHW)的蛋白结合力变弱,从而引发信号通路的调节,引起关节炎.基于以上分析,我们采用NCBI在线blast工具,在人的数据库中比对氨基酸序列序列WPSHWHGRGTAV,共搜索到B细胞抗原受体α链前导蛋白1、2、3,循环B细胞抗体重链的可变区域,B细胞易位基因蛋白,B细胞易位基因蛋白,T细胞关联分子.结论 RA易感共享表位QRRAA和保护性表位DERAA,拥有共同结合核心序列,但亲和比例和程度不同.其亲和肽与B细胞抗原受体蛋白有高度同源性.提示位于HLA-Ⅱ类分子抗原结合槽的α螺旋部位的氨基酸残基,具有与共同的抗原结合特性,仅仅因为与致关节炎抗原肽结合的细微差别,影响呈递给T细胞信号,从而是否发生RA.
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