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目的:利用成熟肿瘤模型小鼠JB6 P+细胞,在细胞和分子水平探索IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展的作用机制,为肿瘤化学预防寻找新的药物提供实验依据和分子靶标。方法:1.研究醉茄素A(Withaferin A,WA)在皮肤肿瘤早期发生发展过程中稳定IDH1的机制。肿瘤促进剂TPA或/和WA处理小鼠JB6 P+细胞,检测IDH1蛋白,观察WA对IDH1蛋白表达的影响。分别在转录、翻译和翻译后水平研究WA稳定IDH1的机制:首先,检测IDH1 mRNA水平;其次,蛋白合成抑制剂CHX预处理后检测IDH1蛋白表达;随后,测定蛋白酶体20S活性;蛋白酶体抑制剂MG132预处理后检测IDH1蛋白表达;最后,免疫沉淀检测IDH1泛素化水平。2.研究IDH1作为抑癌基因抑制皮肤肿瘤早期发生发展的机制。利用过表达载体pcDNA3.1-IDH1和siRNA分别在小鼠JB6 P+细胞过表达和沉默IDH1,检测IDH1对其产物α-KG及线粒体复合体I的影响;同时检测糖酵解中重要代谢酶LDH的表达和活性,观察IDH1对线粒体功能及糖酵解的影响。3.研究IDH1介导醉茄素A抑制皮肤肿瘤发生发展的调控机制。TPA或/和WA处理小鼠JB6 P+细胞,分别检测HIF-1α及其下游Glut-1蛋白表达,VEGF和IDH1下游PHD的活性;LDH蛋白表达,观察WA对HIF-1α通路及糖酵解的影响。在JB6 P+细胞中分别过表达和沉默IDH1,检测上述参数,观察IDH1对HIF-1α通路的影响。4.运用one-way ANOVA分析实验结果,利用Student-Newman-Keuls比较多组均值差异性。结果:1.WA通过抑制泛素-蛋白酶体途径稳定IDH1。1.1 WA抑制TPA诱导的IDH1蛋白表达和活力下调(P<0.05)。1.2各组IDH1 mRNA水平无差异(P>0.05)。1.3 CHX预处理前后,WA均抑制TPA诱导的IDH1表达下调(P<0.05)。1.4 WA抑制TPA诱导的蛋白酶体活性增强(P<0.05)。MG132预处理后降低TPA或/和WA对IDH1蛋白的影响,IDH1蛋白表达接近正常水平(P>0.05)。1.5免疫沉淀前后检测IDH1蛋白及其泛素化水平,WA抑制TPA诱导的IDH1表达下调及泛素化水平增强(P<0.05)。2.抑癌基因IDH1抑制有氧糖酵解,维持线粒体的正常功能。IDH1高表达促进其催化产物α-KG的积累,增强线粒体复合体I活性,抑制LDH蛋白表达及活性(P<0.05);IDH1低表达抑制α-KG生成,下调线粒体复合体I活性(P<0.05);同时,增强LDH蛋白表达。3.WA通过调控IDH1,阻滞HIF-1α通路及糖酵解。3.1 WA抑制TPA诱导的HIF-1α和Glut1蛋白表达上调,VEGF活性增强以及PHD活性降低(P<0.05)。3.2过表达IDH1抑制HIF-1α及Glut1表达,同时增强PHD并抑制VEGF活性(P<0.05);IDH1低表达则结果反之。3.3 WA抑制TPA诱导的LDH表达上调(P<0.05)。结论:1.醉茄素A通过抑制泛素-蛋白酶体途径,稳定TPA诱导的IDH1蛋白表达下调。2.IDH1通过抑制有氧糖酵解,维持线粒体的正常功能发挥抑癌基因的作用。3.WA通过稳定IDH1抑制HIF-1α通路和糖酵解,发挥肿瘤化学预防的作用。