论文部分内容阅读
细小病毒非结构蛋白(NS)在病毒的生活周期中起着非常重要的作用,已经证明其有多种生化特性,例如ATPase活性,Helicase活性以及DNA-Binding活性.家蚕浓核病毒镇江株(BmDNV-Z)虽被归类于细小病毒类,但又不同于细小病毒其他成员,有其明显的独特性.BmDNV-Z含有两种大小不同的DNA,称为VD1和VD2,而且其反向末端重复序列(ITRs)并不像其它细小病毒一样形成“T”域者“Y”型结构,而是形成独特的“锅柄结构”,这就说明了BmDNV在复制上可能具有独特性.本研究通过分析BmDNV-Z VD1的核苷酸序列发现,其ORF2所编码的氨基酸序列中具有Helicase含有的MotifⅠ(WalkerA)基序“GXXXXGKT”,采用PCR方法克隆了该DNA片段,分别进行了原核和杆状病毒载体表达,获得了非结构蛋白NS2,,并对其功能进行了探讨研究.首先提取感染BmDNV-Z的五龄家蚕总DNA,设计特定引物利用PCR技术扩增NS2目的基因,将其与pET28a连接,转化入表达菌株BL21 (DE3)表达,经SDS-PAGE检测并经Ni-NTA柱纯化,得到目的蛋白,经过复性后对其活性进行测定.同时将NS2基因克隆到杆状病毒载体pFastBacHTb中,转化DH10Bac菌株,筛选重组质粒并提取Bacmid,感染家蚕细胞,再以收获的重组病毒感染家蚕,取发病家蚕血液进行SDS-PAGE检验,并纯化回收蛋白,进行活性检测.Helicase活性测定方法如下：将一段53个核苷酸的引物用地高辛标记,与另一条互补的寡核苷酸退火,加入纯化的表达产物,根据表达产物催化DNA释放寡核苷酸的能力确定解旋酶活性.ATPasc活性检验通过钼酸铵比色法验证.结果表明,表达的蛋白具有Helicase活性和ATPase活性,说明BmDNV-Z的NS2是一个多功能蛋白.由于BmDNV-Z其独特的结构使其生化特性或许有别于其他种类的细小病毒,因此对其进行深入研究就有着重要的意义.本实验为以后对于BmDNV-Z的复制机理及其调控机制的研究打下了一定的基础.