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【研究背景】CRISPR/Cas9基因编辑技术及相关衍生技术是近几年发展起来的一种革命性的基因组定向编辑技术。拓展CRISPR/Cas9核酸酶PAM范围是使其在植物中被更广泛应用的关键。国内外多家实验室报道了xCas9在植物上的应用测试,发现其虽能在一定程度上拓展基因组编辑的范围,但包含xCas9的编辑器无法编辑大多数测试的目标靶点,尤其是进行单碱基编辑时,几乎不工作,而这些PAM位点在动物中是工作的。【材料与方法】本研究以农杆菌转化水稻愈伤和稳定转化苗为材料,通过整合串联tRNA和强化sgRNA等功能元件,提升了xCas9编辑效率,研发了以xCas9和胞苷脱氨酶PmCDA1为基础的新型C/T单碱基编辑系统(xCas9-epBE),并对多种PAM位点做了广泛的测试和分析。【结果与分析】本研究首次发现xCas9-epBE在植物中能对基因组上的以GA和松弛型的NG为PAM的靶点进行有效碱基编辑,而且可以利用xCas9进行更广泛PAM位点的基因敲除。动物和植物中均未报道过xCas9-BE可以对GAC和GAG为PAM的靶点实现碱基编辑,因此这一成果可以为动物细胞或玉米等植物细胞提供参考。对以松弛NG为PAM的靶点,本研究开发的xCas9n-epBE未来可与另一新出现的Cas9-NG-CBE互为补充,以实现对更多的以NG为PAM的靶点进行编辑。本研究还对xCas9n-epBE的技术参数进行了具体分析,发现xCas9n-epBE的编辑窗口主要为靶点5端1-7bp,且第2,3,4,5位的C较第1,6,7位的C更易被编辑,T0代植株几乎不产生纯合突变体。【结论】本研究在植物中首次实现xCas9对GAA、GAT、GAC、GAG、NGA、NGT等PAM靶点的编辑,其中GAC和GAG的PAM位点在动物中也尚未实现,因此这一成果可以为动物细胞或玉米等植物细胞进行碱基编辑提供参考,具有重要的应用潜力。