欧洲葡萄‘霞多丽’体细胞胚再生途径建立与转化华东葡萄芪合成酶基因

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欧洲葡萄(Vitis viniferaL.)品种品质优良,但是抗病性差。通过遗传工程转基因生物技术能够定向改良葡萄抗病性。本研究中建立优化葡萄体细胞胚发生途径与遗传转化体系,同时将在华东葡萄白河葡萄-35-1中克隆得到的抗白粉病相关基因芪合成酶基因VpSTSgDNA2转化至感病的欧洲葡萄品种中,研究基因的抗病功能,为改良欧洲葡萄品种抗病性提供依据。以酿酒葡萄品种‘霞多丽’(V.vinifera‘Chardonnay’)为材料,优化外植体类型、诱导培养基、植物生长调节剂等,建立葡萄体细胞胚发生途径。在此再生途径的基础上,转化报告基因GUS,建立葡萄遗传转化体系,比较不同转基因方法的遗传转化效率。将课题组前期从抗白粉病的华东葡萄白河葡萄-35-1中克隆的抗白粉病相关基因芪合成酶基因VpSTSgDNA2通过农杆菌介导方法转化至‘霞多丽’葡萄中,通过PCR、Southern blot验证后对2个转基因株系接种葡萄白粉病菌验证基因的抗病功能。研究表明,‘霞多丽’的花蕾在胚性愈伤诱导培养基(MSl、PIV、MC)上能够诱导出胚性愈伤组织,PIV培养基适于胚性愈伤诱导。添加毒莠定能提高胚性愈伤诱导效率。适宜的胚性保持和扩繁培养基是添加2 mg·L-1毒莠定的MS培养基,适宜的体细胞胚萌发成苗培养基是含有0.2mg·L-1KT、0·1 mg·L-1NOA的MS培养基。农杆菌介导的遗传转化获得的抗性体细胞胚中GUS表达量高于基因枪遗传转化法。葡萄原胚团为适宜的农杆菌介导的遗传转化受体材料。试验中获得69株‘霞多丽’抗性株系。PCR检测结果表明,32株抗性株系为阳性株系。对经过Southem blot验证的转基因‘霞多丽’叶片接种白粉菌,转基因叶片中VpSTSgDNA2受白粉菌诱导转录;在目的基因转录的同时,查尔酮合成酶基因表达受抑制,目的基因的产物,反式白藜芦醇和ε-葡萄素的含量增加。同时,转基因葡萄叶片中有H2O2的积累。转基因葡萄叶片上的白粉菌菌丝密度低于对照葡萄叶片。结果初步表明,转入VpSTSgDNA2的‘霞多丽’葡萄能够抑制白粉菌的生长,对白粉
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