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七星瓢虫(Coccinella septempunctata Linnaeus)是重要的常见典型的捕食性农业天敌之一,在生物防治上有重要作用.七星瓢虫存在冬滞育现象,了解其滞育机制对实际生产应用七星瓢虫防治害虫有着指导意义.滞育是昆虫对不良环境适应性的一种表现,通过研究了解滞育相关基因是挖掘滞育机制的重要手段.抑制性消减杂(suppression subtractivehybridization,SSH)技术适用于遗传背景较小的样品,且此技术能使差异性表达的低丰度转录本得到1000 倍的放大,简化了文库的分析,通过构建抑制性消减杂交文库,寻找表达差异基因,为研究七星瓢虫滞育的分子机制提供可靠线索.采用clontech 公司的PCR-Select cDNA Subtraction Kit 构建七星瓢虫滞育与非滞育雌虫抑制性消减杂交文库.用Invitrogen 公司的Trizol 试剂提取滞育与非滞育七星瓢虫雌虫的腹部组织的总RNA 效果好,能满足下游实验需要.由于七星瓢虫腹部组织含有的脂肪体含量很大,脂肪含量高,50mg 的组织加1mL 的Trizol,进行氯仿抽提前需要把漂浮在裂解液上的液态脂肪用枪头吸干净；由于七星瓢虫腹部组织的蛋白质含量也较多,需要进行两次氯仿抽提,减少蛋白质和基因组的污染.结合电泳结果和OD 比值判断提取的总RNA 的质量合格后,使用SMARTerTM PCR cDNA Synthesis Kit(Clontech 公司)进行反转录和LD-PCR 得到双链cDNA,进行LD-PCR 时,选择的最佳循环数是反应达到平台期的循环数‐1,选择的最佳循环数过大,导致非特异性扩增,过柱纯化后进行电泳发现大分子DNA 量过多,抹带现象严重.双链cDNA 经过纯化后使用Rsal 酶酶切,再纯化,过夜连接接头,两次杂交,两次PCR(第二次为巢式PCR),然后根据七星瓢虫看家基因18s rRNA 设计特异引物对正向文库(以非滞育七星瓢虫的cDNA 为tester,以滞育七星瓢虫的cDNA 为driver)和反向文库(以滞育七星瓢虫的cDNA 为tester,以非滞育七星瓢虫的cDNA 为driver)进行消减效率检测.检测合格后,纯化第二次PCR 产物,连接到PGEM-Teasy 载体上,用化转的方法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中得到原始文库.通过蓝白斑筛选,正向文库挑选白色单菌落524 个,反向文库挑取白色单菌落510 个接种于LB 培养基中37℃过夜培养,用二次巢式PCR的引物为引物,对所有单菌落进行菌落PCR,-80℃下保留菌种于20％甘油中.1034 个菌落PCR电泳结果显示重组成功率达到95％,插入的片段大多数在100-750bp 之间,符合酶切结果.经过测定,构建的文库含有重组子数超过1.0×104 个,得到的重组子数符合构建抑制性消减杂交文库的要求,说明构建的文库质量高,为筛选出滞育相关基因提供了结实的保障和基础.