【摘 要】
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抑制牛骨髓间充质干细胞中朊蛋白基因的表达,为抗疯牛病转基因克隆牛的制作提供体细胞来源.利用RNAi技术,根据NCBI数据库中牛源PRNP基因cDNA序列,运用生物学软件设计3段s
【机 构】
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青岛农业大学动物胚胎工程中心, 山东青岛266109
【出 处】
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2015第三届中国肉牛选育改良与产业发展国际研讨会
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抑制牛骨髓间充质干细胞中朊蛋白基因的表达,为抗疯牛病转基因克隆牛的制作提供体细胞来源.利用RNAi技术,根据NCBI数据库中牛源PRNP基因cDNA序列,运用生物学软件设计3段siRNA序列和1个阴性对照序列,分别将其连接到RNA干扰载体pRNAT-U6.1/Neo上构建成shRNA载体,并将构建成功的干扰载体转染牛骨髓间充质干细胞(BMSC)；通过Real-time PCR和Western bloting筛选抑制效果最佳的载体；并用800μg/mL G418对干扰效率最佳的细胞株进行筛选.成功构建了3个靶向shRNA载体和1个阴性对照shRNA载体；转染后48h在荧光镜下检测各组均可观察到绿色荧光的表达；Real-time PCR和Western bloting结果显示,3个靶向shRNA载体在不同时间段均在一定程度上下调了PRNP mRNA和蛋白的表达,抑制了朊蛋白PrPc的生成,筛选了一个最佳干扰载体；通过药物筛选出了稳定转染的细胞株.本研究获得了一个有效抑制朊蛋白基因表达的shRNA载体,并筛选出稳定转染的细胞株,可为抗疯牛病体细胞核移植提供供体细胞.
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