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目的：趋化因子CXCL12及其受体共同参与了多种慢性肝脏疾病的发病过程,本研究通过观察几种慢性肝脏病变肝组织中趋化因子CXCL12β亚型的转录及蛋白水平的表达,以及不同慢性肝脏疾病患者血清中CXCL12β的表达情况,结合患者的临床表现、实验室检查等进行分析,探讨趋化因子CXCL 12 β转录亚型在肝癌、肝硬化和肝纤维化中的临床意义,为上述疾病的临床诊疗提供更好的实验室证据。
方法：收集24份非重复性冰冻肝癌组织及其对应癌周组织标本,样本来源于我院外科行肝癌切除术的患者,8份冰冻正常肝组织来源于肝移植手术的供肝,所有新鲜肝组织均于离体后立刻置于-80℃备用。收集49份肝脏石蜡组织样本,来源于行B超引导下肝穿刺术或施行肝脏切除手术的各种慢性肝病患者。根据病理诊断,将标本分为四个组：原发性肝细胞癌组(Primary HepatocellularCarcinoma,HCC)、癌周组织组(Tumor-surrounding tissue,TST)、肝硬化组(Livercirrhosis,LC)、肝纤维化组(Liverfibrosis,LF)。正常对照(Normal,N)5例肝组织标本,来源于肝移植手术中的供肝。4份肝纤维化大鼠石蜡切片标本是由四氯化碳(cc14)诱导的。所有标本离体后,立即甲醛固定,经常规石蜡包埋,切片厚度为5 μm,置于阴凉干燥处,避光备用。收集71例慢性肝炎患者血清样本,来源于行B超引导下肝穿刺术的患者,依据其病理诊断的肝纤维化程度：S0＼S1＼S2＼S3进行分组。此外,收集临床确诊的HCC患者血清样本26份、LC患者血清样本24份。对照组34例血清标本来源于体检健康人群。所有患者的诊断均参照2000年西安肝病会议标准。采集后的非抗凝血液标本,于室温静置2小时,待血液凝固后,经3000转/min(Revolutions per minute,rpm)离心10 min,分装于3个Eppendorf管内,一80℃冷冻备用。冰冻组织标本用Trizol法提取组织总RNA,逆转录成cDNA,采用聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)检测CXCL12 β转录亚型在肝组织中的转录表达,并利用Ouantity One软件对产物进行半定量。石蜡标本应用免疫组织化学染色(Immunohistochemical,IHC),一抗为山羊抗人CXCL12 β多克隆抗体,二抗为HRP标记兔抗山羊多克隆抗体,采用DAB法显色,观察肝组织中CXCL12 β表达强度,在高年资病理医师的指导下进行判读,同时采用图像分析软件Image—ProPlus 6.0处理,对结果进行半定量分析。血清标本采用酶联免疫吸附试验(Enzyme—linkedimmunosor-bent assay,ELISA)中的双抗夹心法,通过系列标准品计算标准曲线,线性范围是125pg/ml-8000pg/ml,计算出患者血清中相应CXCL12 β水平。所有结果采用windows SPSS 13.0进行统计学分析。
结果：CXCL12 β在HCC、TST及N组织中均有转录表达,其相对灰度值(Relative gray value,RGV)分别为：0.8505+0.2268、0.7213±0.1700、0.5703±0.2106。其中,HCC组高于TST组,差异具有显著性(t=0.023,P<0.05)，也明显高于N组(t=0.01,P<0.05)；TST组和N组在统计学上虽然没有显著性差异,但P值也接近于0.05(t=0.057,P>0.05)。在肝组织切片中,CXCL12 β在HCC、TST、LC、LF、N组织中均有表达,通过显微镜观察及软件分析,发现CXCL12 B在肝癌和肝硬化组织中表达量高于其它病理类型的肝组织,依次为HCC>TST>LC>LF>N。对CC14诱导的肝纤维化大鼠肝组织检测发现CXCL12 β随着纤维化程度加重其表达量明显增加。血清ELISA检测结果表明,HCC、LC、LF、N患者血清中CXCLl2 B水平分别是：2487.96±1192。79、1177.12±541.78、1576.2334±1188.95、281.69±217.08pg/ml。其中HCC、LC、LF、N组间均有明显差异(P<0.05)。将肝纤维化组依据纤维化程度(既S0、S1、S2、S3)进一步分组,CXCL12B水平分别是1 500.676±593.3979pg/ml、1503.481±772.9757pg/ml、1838.711±615.1526pg/ml、1898.591±936.85971pg/ml。虽然在统计学上未发现明显差异,但是依然可以发现随着纤维化程度的加重。CXCL12β水平逐渐升高。
结论：1、趋化因子CXCL12β转录子在HCC、TST、N组织中均有表达。且其mRNA含量在不同组织中存在差异。2、应用IHC法发现CXCL12 β在N、LF、LC、TST、HCC中表达逐渐增高,依据其在不同组织中的表达特点,考虑与肝组织损伤及损伤后修复、肿瘤血管发生等有关。3、血清学CXCL12 β的表达量为：HCC>LF>LC>N。随着肝组织纤维化程度的加重,血清中CXCL12 β表达量也逐渐升高,CXCL12β可能参与了肝纤维化形成。CXCL12 β在LF、LC至HCC中的不同表达特点,也提示其在这些肝病的发病中可能发挥着特殊重要作用,值得进一步研究。
方法：收集24份非重复性冰冻肝癌组织及其对应癌周组织标本,样本来源于我院外科行肝癌切除术的患者,8份冰冻正常肝组织来源于肝移植手术的供肝,所有新鲜肝组织均于离体后立刻置于-80℃备用。收集49份肝脏石蜡组织样本,来源于行B超引导下肝穿刺术或施行肝脏切除手术的各种慢性肝病患者。根据病理诊断,将标本分为四个组：原发性肝细胞癌组(Primary HepatocellularCarcinoma,HCC)、癌周组织组(Tumor-surrounding tissue,TST)、肝硬化组(Livercirrhosis,LC)、肝纤维化组(Liverfibrosis,LF)。正常对照(Normal,N)5例肝组织标本,来源于肝移植手术中的供肝。4份肝纤维化大鼠石蜡切片标本是由四氯化碳(cc14)诱导的。所有标本离体后,立即甲醛固定,经常规石蜡包埋,切片厚度为5 μm,置于阴凉干燥处,避光备用。收集71例慢性肝炎患者血清样本,来源于行B超引导下肝穿刺术的患者,依据其病理诊断的肝纤维化程度：S0＼S1＼S2＼S3进行分组。此外,收集临床确诊的HCC患者血清样本26份、LC患者血清样本24份。对照组34例血清标本来源于体检健康人群。所有患者的诊断均参照2000年西安肝病会议标准。采集后的非抗凝血液标本,于室温静置2小时,待血液凝固后,经3000转/min(Revolutions per minute,rpm)离心10 min,分装于3个Eppendorf管内,一80℃冷冻备用。冰冻组织标本用Trizol法提取组织总RNA,逆转录成cDNA,采用聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)检测CXCL12 β转录亚型在肝组织中的转录表达,并利用Ouantity One软件对产物进行半定量。石蜡标本应用免疫组织化学染色(Immunohistochemical,IHC),一抗为山羊抗人CXCL12 β多克隆抗体,二抗为HRP标记兔抗山羊多克隆抗体,采用DAB法显色,观察肝组织中CXCL12 β表达强度,在高年资病理医师的指导下进行判读,同时采用图像分析软件Image—ProPlus 6.0处理,对结果进行半定量分析。血清标本采用酶联免疫吸附试验(Enzyme—linkedimmunosor-bent assay,ELISA)中的双抗夹心法,通过系列标准品计算标准曲线,线性范围是125pg/ml-8000pg/ml,计算出患者血清中相应CXCL12 β水平。所有结果采用windows SPSS 13.0进行统计学分析。
结果：CXCL12 β在HCC、TST及N组织中均有转录表达,其相对灰度值(Relative gray value,RGV)分别为：0.8505+0.2268、0.7213±0.1700、0.5703±0.2106。其中,HCC组高于TST组,差异具有显著性(t=0.023,P<0.05)，也明显高于N组(t=0.01,P<0.05)；TST组和N组在统计学上虽然没有显著性差异,但P值也接近于0.05(t=0.057,P>0.05)。在肝组织切片中,CXCL12 β在HCC、TST、LC、LF、N组织中均有表达,通过显微镜观察及软件分析,发现CXCL12 B在肝癌和肝硬化组织中表达量高于其它病理类型的肝组织,依次为HCC>TST>LC>LF>N。对CC14诱导的肝纤维化大鼠肝组织检测发现CXCL12 β随着纤维化程度加重其表达量明显增加。血清ELISA检测结果表明,HCC、LC、LF、N患者血清中CXCLl2 B水平分别是：2487.96±1192。79、1177.12±541.78、1576.2334±1188.95、281.69±217.08pg/ml。其中HCC、LC、LF、N组间均有明显差异(P<0.05)。将肝纤维化组依据纤维化程度(既S0、S1、S2、S3)进一步分组,CXCL12B水平分别是1 500.676±593.3979pg/ml、1503.481±772.9757pg/ml、1838.711±615.1526pg/ml、1898.591±936.85971pg/ml。虽然在统计学上未发现明显差异,但是依然可以发现随着纤维化程度的加重。CXCL12β水平逐渐升高。
结论：1、趋化因子CXCL12β转录子在HCC、TST、N组织中均有表达。且其mRNA含量在不同组织中存在差异。2、应用IHC法发现CXCL12 β在N、LF、LC、TST、HCC中表达逐渐增高,依据其在不同组织中的表达特点,考虑与肝组织损伤及损伤后修复、肿瘤血管发生等有关。3、血清学CXCL12 β的表达量为：HCC>LF>LC>N。随着肝组织纤维化程度的加重,血清中CXCL12 β表达量也逐渐升高,CXCL12β可能参与了肝纤维化形成。CXCL12 β在LF、LC至HCC中的不同表达特点,也提示其在这些肝病的发病中可能发挥着特殊重要作用,值得进一步研究。