Wnt/β连环蛋白信号在人真皮成纤维细胞表型转化中的作用及机制

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目的了解Wnt/β连环蛋白信号在人正常真皮Fb向肌成纤维细胞(MFb)表型转化中的作用及机制。方法采用酶消化法分离培养人难常皮肤真皮Fb。(1)实验1。按随机数字表法将细胞分为4组:对照组,采用无血清DMEM培养液(以下简称培养液)培养;TGF-β1组,用含10ng/ml,氧组人TGF-β1(浓度下同)的培养液培养;Wnt3a组,用含150ng/mL重组人Wnt3a(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+Wnt3a组,用含重组人TGF-β1和重组人Wnt3a的培养液培养。48h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法,检测Fbβ连环蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA及蛋白表达水平:(2)实验2。按照随机数字表法将细胞分为4组:对照组、TGF-β1组,处理方法均同实验l;SB415286(糖原合酶激酶3β阻断剂)组,用含10μmol/LSB415286(浓度下同)的培养液培养;TGF-β1+SB415286组,用含重组人TGF-β1和SB415286的培养液培养。48h后,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测Fb α-SMA的tuRNA和蛋白表达水平;用免疫荧光细胞化学法检测α-SMA阳性表达情况。各项检测重复3次,对数据进行方差分析及LSD-t检验。结果(1)实验1:①β连环蛋白的mRNA表达水平:对照组、TGF-β1组、Wnt3a组和TGF-β1+Wnt3a组Fb组间比较,差异无统计学意义(F=0.302,P=0.823)。②β连环蛋白的蛋白表达水平:4组比较,差异l有统计学意义(F=16.713,P=0.001),与对照组表达水平(0.34±0.11)相比,TGF-β1组、Wnt3a组均显著上调(0.73±0.12、0.82-0.17,t值分别为3.028、3.727,P〈0.05或P〈0.01)。TGF-β1+Wnt3a组(1.23±0.21)显著高于其余3组(t值分别为6.911、3.883、3.184,P值均小于0.01)。③α-SMAmRNA表达水平:4组比较,差异有统计学意义(F=31.830,P=0.001);与对照组相比,TGF-β.组硅著上调,wnt3a组下调分别为6.759、2.535,P〈0.05或P〈0.01);TGF-β1+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.532,P〈0.01),④α-SMA蛋白表达水平:对照组、TGF-α1组、Wnt3a组、TGF-p1+Wnt3a组分别为0.83±0.17、1.43±0.20、0.534±0.12、0.89±0.14(F=16.597,P=0.001)..与对照组相比,TGF-β1组显著下凋,Wnt3a组下调(t值分别为4.582、2.291,P〈0.05或P〈0.01);TGF-β11+Wnt3a组低于TGF-β1组(t=4.123,P〈0.01)。(2)实验2①α-SMAmRNA表达水平:4组比较,差芹有统计学意义(F=34.101,P=0.001)。SB415286组明显低于对照组(F=2.511,P〈0.05),TGF-β1+SB415286的明显低于TGF-β1组(t=3.587,P〈0.01)②α-SMA蛋白表达水平:4组细胞比较,差异有统计学意义(F=11.381,P=0.003),SB415286绀显著低于对照组(t=2.364,P〈0.05),TCF-β1+SB415286组低于TGF-β1组(t=2.556,P〈0.05)。③免疫荧光细胞化学法检测显示,对照组α-SMA表达微弱;TGF-β1组α-SMA表达较对照组显著增强(t=11.198,P〈0.01);SB415286组表达较对照组减少,TGF-β1+SB415286组表达较TGF-β1组湿著减少(t=5.902,P〈0.01)。结论Wnt/β连环蛋白信号可能参与Fh细胞表型转化,并且对TGF-β1所介导的促转化效应起负性调控作用。

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