家蚕是一种重要的经济动物和模式昆虫,丝腺是家蚕重要的吐丝器官,直接决定着家蚕产丝量的多少。在家蚕由幼虫到蛹的变型期,丝腺器官发生了剧烈的凋亡退化。目前,细胞凋亡分子调控机制在哺乳动物中的研究较为清楚,但对于家蚕中的凋亡分子机制知之甚少。所以,研究家蚕变态期丝腺的凋亡过程及其主要凋亡通路相关基因的表达,对解析丝腺凋亡的分子机理及细胞或组织退化和凋亡的程序性细胞信号通路的基础性研究有重要意义。本研究克隆分析了细胞凋亡通路中的重要基因Fadd、Daxx和Dredd等,着重研究其在家蚕细胞凋亡和家蚕丝腺退化中的作用及其相互之间的互作调控关系。Fadd(含死亡结构域的Fas受体连接蛋白)是一种胞内蛋白,负责在细胞膜表面的死亡受体和细胞质内的死亡激酶间传递死亡信号。通过在Bm N细胞中进行Bm Fadd基因的干扰和过表达,当Bm Fadd基因的表达量受到siRNA干扰时,其细胞凋亡率显著下降,而Bm Fadd基因过表达后,细胞凋亡率上升,表明Bm Fadd基因与细胞凋亡呈正相关。实时荧光定量PCR对Bm Fadd基因在家蚕不同生长时期和不同组织中的转录表达情况发现,该基因在家蚕吐丝期及化蛹第1天的丝腺,特别是后部丝腺中的表达量极高。在家蚕后部丝腺中,Bm Fadd的表达量在五龄前期维持较低水平,而在家蚕吐丝期达到峰值,至蛹期逐渐下降。结果表明Bm Fadd参与了家蚕变态发育过程中丝腺的退化。Daxx(死亡结构域相关蛋白)是一种具有多种生物功能的核蛋白,被鉴定为具有调控凋亡信号途径的功能分子和与Fas的死亡结构域(death domain of Fas,FasDD)发生相互作用的蛋白。Bm N细胞中进行Bm Daxx基因的过表达和siRNA干扰实验,并检测caspase-3激活数,同时利用短波紫外线(UVC)和放线菌素D诱导细胞凋亡。实验数据表明,当Bm Daxx基因表达量增高时,能够引起caspase-3酶活性的增高,细胞凋亡率也相应升高。实时荧光定量PCR检测Bm Daxx基因在家蚕不同生长时期、不同组织中的转录表达情况,结果发现,该基因在家蚕吐丝时的丝腺中表达量开始显著升高,在吐丝36小时时的丝腺中表达量达到高峰,特别是在后部丝腺中的表达量最高,这与变态期家蚕丝腺的发育变化情况一致。Dredd为caspase家族同源蛋白。对Bm N细胞进行诱导凋亡、dsRNA干扰处理,发现凋亡的细胞中Bm Dredd表达量升高,而RNA干扰Bm Dredd的表达则减小细胞凋亡率,提高正常细胞数量。检测不同时期家蚕丝腺中Bm Dredd表达量,发现丝腺凋亡期间,Bm Dredd表达量升高,表明Bm Dredd与丝腺凋亡有着重要的联系。在蜕皮激素饲喂家蚕后,Bm Dredd表达量升高,说明Bm Dredd为蜕皮激素下游靶基因。Caspase抑制剂处理丝腺降低了Bm Dredd表达量,注射dsRNA-Bm Dredd到家蚕丝腺可以延迟丝腺凋亡,在丝腺中过表达Bm Dredd引起过表达部位caspase-3活性的升高,结果都显示Bm Dredd参与和诱导丝腺凋亡。Caspase抑制剂处理家蚕Bm N细胞,发现在caspase抑制剂处理的Bm N细胞中caspase-3酶活性有显著的降低,流式细胞术检测细胞凋亡率也明显下降,Bm Daxx,Bm Fadd和Bm Dredd三个基因的表达量也有明显降低。在注射caspase抑制剂的家蚕中,Bm Daxx、Bm Fadd和Bm Dredd的转录水平也明显降低。因此推测这三个基因在细胞和个体水平上都相互作用并同时参与凋亡通路。