大鼠端粒酶逆转录酶对神经元缺氧缺血性损伤的保护作用

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目的端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶的重要组成成分,能保护细胞抵抗凋亡,促进细胞存活。我们拟通过构建神经元体外缺氧缺血损伤模型,探讨大鼠TERT对缺氧缺血性脑损伤中神经元的保护作用。方法取生后当天SD大鼠,处死后取大脑皮层进行神经元原代培养。对神经元进行体外氧糖剥夺实验(oxygen glucose deprivation,OGD)以模拟细胞缺氧缺血,将神经元培养基更换为无糖培养液后置入5%CO2、1%O2、94%N2的三气培养箱中进行缺血缺氧处理3h,然后将培养液更换为正常神经元培养基,置入常氧培养箱进行复氧。复氧后不同时间点收集细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光法检测TERT在各时间点神经元中的表达和分布,并应用Western blot定量检测TERT蛋白表达。通过脂质体介导将含TERT反义核酸的质粒转染神经元,特异性阻断神经元TERT表达。转染后48h,将TERT表达抑制组(TERT-)和空载体转染组神经元进行缺氧缺血处理,于复氧后不同时间点收集TERT-组和空载体转染组细胞,用免疫荧光及Western blot检测TERT和cleaved caspase3表达情况,并用TUNEL法检测神经元凋亡情况。结果免疫细胞化学及免疫荧光结果显示常氧条件下神经元中有少量TERT表达,缺血缺氧后TERT表达明显增高,胞浆和突起均有表达。Western blot结果示TERT蛋白表达在复氧后0h即明显增高(p<0.05),维持在较高水平至48~72h逐渐下降,但仍高于对照组(p<0.05)。通过脂质体介导转染抑制神经元TERT表达,免疫荧光结果显示TERT-组神经元在复氧后24hTERT的表达低于空载体转染组。TUNEL染色结果示TERT-组在复氧后24h神经元凋亡高于空载体转染组。Western blot结果示TERT-组神经元在复氧各时间点(8h、24h、48h)TERT表达均低于空载体转染组(p<0.05),而复氧后各时间点神经元CC3表达水平高于空载体转染组(p<0.05)。结论缺氧缺血损伤能够诱导大鼠神经元中TERT表达。TERT表达抑制后神经元的凋亡明显增加,提示TERT可能对缺氧缺血损伤中神经元凋亡起保护作用。
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