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目的：探索在体外培养条件下,牛垂体提取物(Bovine Pituitary Extract,BPE)能否促进角膜基质细胞的体外增殖,并能维持静止态表型.方法：在进行离体细胞培养前,每只日本大耳白兔都要进行活体激光扫描角膜共焦显微镜检查,观察角膜基质层静止态基质细胞形态及数量.在进行离体细胞培养时,空气栓塞处死实验动物,获取角膜组织后去除后弹力层、内皮细胞及上皮细胞,采用酶消化法进行角膜基质细胞体外培养.依据所选培养液的不同,实验分为三组：BPE组采用K-SFM (Keratinocyte-serum free medium)+50μg/ml BPE,FBS (Fetal Bovine Serum)组采用K-SFM+10％FBS,对照组采用K-SFM.相差显微镜下观察三组细胞形态及生长变化；,采用免疫荧光技术检测CD34的表达,CD34的表达量采用平均荧光强度进行分析.BPE组进行传代培养,相差显微镜下观察细胞形态及生长变化；采用免疫荧光技术检测CD34的表达,对传代培养细胞进行定性研究,应用Alexa Fluor 543标记的鬼笔环肽(phaUoidin)检测传代培养的角膜基质细胞中F-acfin的分布.结果：活体激光扫描角膜共焦显微镜观察结果显示角膜基质层中可见明亮的角膜基质细胞核；前基质层角膜基质细胞平均密度为398±47个/mm2,后基质层角膜基质细胞平均密度为232±23个/mm2.原代细胞培养两周,BPE组观察细胞贴壁生长呈树突状,增殖融合后交织成网状；细胞传代培养至第三代,仍可见大量CD34表型阳性的细胞,鬼笔环肽染色可见典型树突样结构.FBS组细胞贴壁生长,在培养早期细胞呈树突样,在血清刺激条件下,细胞形状逐渐转变为长梭形,增殖融合后形成致密细胞膜片.对照组观察细胞贴壁生长呈树突状,细胞增殖缓慢,未融合交织成网状或形成膜片.CD34荧光染色结果显示：BPE组平均荧光强度为6.07±2.04；FBS组平均荧光强度为1.00±0.53；对照组平均荧光强度较低,介于二者之间；BPE组和对照组中静止状态的角膜基质细胞较少转变为成纤维细胞表型.结论：在体外培养条件下,添加BPE的无血清培养液能显著提高角膜基质细胞的增殖能力,并有效维持角膜基质细胞的静止态表型；从而快速、大量获取静止态表型的角膜基质细胞,为角膜基质层的体外构建提供种子细胞.