产单核细胞李氏杆菌（Listeria monocytogenes），是一种人畜共患的食源性病原菌，可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等，大约有30％的致死率。因此研制产单核细胞李氏杆菌的快速检测方法非常必要。溶血素O(Listeriolysin O，LLO)是产单核细胞李氏杆菌最主要的毒力因子，由hly基因编码。本研究的目的是对LLO进行定点突变，以期提高其免疫原性，制备高亲和力的单克隆抗体，提高产单核细胞李氏杆菌的检测灵敏度。本研究通过常规PCR方法扩增hly基因，构建重组质粒pMD18-T-hly，将扩增的hly基因的第52位的亮氨酸定点突变为苯丙氨酸，然后在将突变前后的扩增基因定向克隆到pET-28b载体中，分别构建原核表达重组载体pET-28b-hly和pET-28b-L52P。利用IPTG对重组子进行诱导，重组蛋白以包涵体形式表达，因此在变性条件下利用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行纯化，并将纯化后蛋白制成抗原，制备多克隆抗体，通过ELISA检测，LLO蛋白抗体效价为3×105，突变LLO蛋白抗体效价为6×105，并且测得突变LLO蛋白比LLO蛋白免疫反应性OD值增强0.44，P<0.05，这说明突变LLO的免疫原性明显增强。应用杂交瘤技术，将纯化后的突变LLO蛋白制各单克隆抗体，并确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件，以建立的该方法对融合后杂交瘤细胞进行检测筛选，共获得阳性杂交瘤细胞株II株。利用有限稀释法进行3次亚克隆后，最终获得单抗2株，分别命名为286和SD3，腹水ELISA效价以286较高，可达1:320000，平均腹水中抗体效价要比细胞上清中高大约533倍，此单克隆抗体的获得为产单核细胞李氏杆菌溶血素O的研究以及快速诊断方法的建立奠定了基础。