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目的:转录因子hoxb4可促进造血干细胞增殖的正向调节,在增加干细胞数量的同时可几乎不影响其分化,其机制可能与上下游基因的功能有关,但至今尚不明确.本实验选择cdh5为研究对象,探究cdh5基因在hoxb4过表达转基因斑马鱼胚胎期造血组织中的表达情况;并且在野生型斑马鱼胚胎中过表达cdh5基因,研究其对造血发育的影响,并探讨cdh5基因与hoxb4基因可能的调控关系.
方法:收集HoxB4实验组和egfp对照组转基因斑马鱼18hpf、24hpf、30hpf、36hpf、48hpf、72hpf的胚胎,流式细胞仪分选阳性细胞,提取各标本总RNA制备cDNA,用实时荧光定量PCR的方法检测标本中cdh5基因在mRNA水平的表达量:构建edh5基因全长表达质粒并测试表达情况,体外转录成mRNA,经显微注射的方法将其导入单细胞期斑马鱼胚胎,收取早期发育节点的阳性胚胎,提取各时间点标本总RNA制备cDNA,经实时荧光定量PCR检测原始造血和成体造血标致基因mRNA水平的表达量。
结果:成功分选出了目的细胞,提取其总RNA,并逆转制备了cDNA。
结论:hoxb4过表达转基因斑马鱼胚胎期造血组织中cdh5的表达量明显升高,高水平表达的时程明显延长。成功的构建了cdh5-egfp pCS2+全长重组质粒,制备出了cdh5-egfp的mRNA,在野生型斑马鱼胚胎中过表达cdh5时可以引起原始造血增强;成体造血的早期阶段也明显增强。在斑马鱼胚胎过表达Hoxb4可以引起造血组织cdh5表达增强,在野生型斑马鱼胚胎中表达cdh5可以产生与过表达hoxb4类似的造血增强效应,cdh5基因可能是hoxb4基因的下游靶基因,共同参与了胚胎早期阶段造血发育的调控。