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研究目的:细胞自噬是近年来运动与骨骼肌机能领域的研究热点之一,多数报道主要集中于骨骼肌细胞自噬、线粒体自噬等,而有关参与肌肉收缩的重要细胞器——内质网自噬的相关研究鲜有报道。内质网自噬是一种由内质网应激诱导发生针对冗余内质网的选择性自噬,主要功能是控制内质网的体积维持细胞稳态,在机体生理和病理调解中具有重要作用。本研究拟围绕骨骼肌细胞中内质网应激-自噬的相关效应与机制这一问题,以内质网自噬受体蛋白FAM134B的分子作用为切入点;通过离体培养大鼠成肌细胞(L6细胞),并施以内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(TG)和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-PBA)处理;观察内质网应激-自噬反应的变化情况,探究FAM134B在骨骼肌细胞内质网应激-自噬中的作用机制,以期为运动与骨骼肌适应的生物学机制研究提供新的实验依据。研究方法:(1)研究对象与分组:将L6大鼠骨骼肌成肌细胞(由中国医学科学院基础医学研究所即协和细胞资源中心提供)传代培养并诱导分化成熟后,分为3组,即正常对照组(N)、内质网应激诱导剂组(TG组)、内质网应激抑制剂组(4-PBA组)。(2)干预方案:N组正常培养细胞并诱导分化成熟,无其他干预因素;TG组待细胞诱导分化完成,将分化培养基更换为毒胡萝卜素培养基,浓度10μmol/L,24h后收集细胞;4-PBA组待细胞诱导分化完成,将分化培养基更换为4-苯基丁酸培养基,浓度5μmol/L,24h后收集细胞。(3)样本采集:(1)制备蛋白样品:收集细胞后经PBS洗涤、胰酶消化吹打、离心、裂解后,制备细胞蛋白样品,并采用梯度超速离心法获得细胞内质网蛋白。后续用于Western Blot检测。(2)制备细胞爬片:将经过计数的细胞悬浮液移入培养板,使灭菌盖玻片完全浸入培养液中,放至培养箱,当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部面积2/3时,取出盖玻片。经免疫荧光染色后采用激光共聚焦显微镜观测。(4)指标检测:Western Blot法检测L6细胞中GRP78、CRT蛋白表达和内质网中FAM134B、LC3蛋白表达;免疫荧光双染结合激光共聚焦观察FAM134B、LC3与CRT共定位情况;免疫共沉淀法(Co-IP)观测L6细胞CRT和FAM134B、FAM134B和LC3的相互作用与结合量。研究结果:(1)L6细胞GRP78、CRT蛋白表达变化:TG组L6细胞GRP78、CRT蛋白表达均显著高于N组和4-PBA组(P<0.01),而N组与4-PBA组相比则无显著差异(P>0.05)。(2)L6细胞内质网FAM134B、LC3蛋白表达变化:TG组L6细胞内质网FAM134B、LC3蛋白表达均显著高于N组和4-PBA组(P<0.01),而N组与4-PBA组相比则无显著差异(P>0.05)。(3)FAM134B与CRT、LC3与CRT共定位变化:TG组与N组相比L6细胞FAM134B与CRT共定位显著增多((P<0.01);而4-PBA组FAM134B与CRT共定位比N组虽略有减少,但是无显著性差异(P>0.05)。TG组与N组相比LC3与CRT共定位显著增多((P<0.01);而4-PBA组FAM134B与LC3共定位比N组虽略有减少,但是无显著性差异(P>0.05)。(4)CRT和FAM134B、FAM134B和LC3相互作用变化:Co-IP实验证实,在L6细胞中CRT与FAM134B、FAM134B与LC3之间存在相互作用。TG组CRT与FAM134B结合量显著高于N组和4-PBA组(P<0.01),分别升高了2.94倍和3.43倍,而4-PBA组与N组相比无显著性差异(P>0.05)。TG组FAM134B与LC3结合量显著高于N组和4-PBA组(P<0.01),分别升高了2.21倍和2.84倍,而4-PBA组与N组无显著性差异(P>0.05)。研究结论:(1)施加内质网应激诱导剂毒胡萝卜素后,L6细胞内质网应激蛋白GRP78、CRT表达上调,FAM134B和LC3转位至内质网且与CRT共定位。(2)免疫共沉淀发现L6细胞中CRT与FAM134B、FAM134B与LC3之间具有相互作用,且在内质网应激诱导剂毒胡萝卜素处理后作用加强。(3)结合上述两方面,提示骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的机制为:内质网功能发生障碍诱导内质网应激后,CRT蛋白表达上调,FAM134B作为自噬受体蛋白选择性锚定CRT并招募LC3,三者相互作用协同调控骨骼肌细胞内质网应激-自噬反应的发生。