【摘 要】
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目的 探讨ADAM10在急性髓系白血病发病中的作用及其机制.方法 1.实时定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)及Western Blot检测ADAM10在三种
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目的 探讨ADAM10在急性髓系白血病发病中的作用及其机制.方法 1.实时定量PCR(real time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)及Western Blot检测ADAM10在三种髓系白血病细胞系(U937、K562、HEL)中的表达；2.pLV-shRNA-ADAM 10-EGFP(2A)Puro的构建：设计三对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒pLV-shRNA-ADAM10-EGFP(2A)Puro中,其中一对为阴性对照组,构建pLV-ADAM 10-shRNA1,pLV-ADAM10-shRNA2及对照组pLV-non-ADAM10-shRNA,通过逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)及测序进行鉴定；3.分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,包装慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达水平检测病毒滴度,感染HEL细胞后,使用嘌呤霉素筛选获得GFP阳性细胞,Q-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测ADAM10的表达,筛选出干扰效率最高的序列；4.干扰ADAM10后HEL细胞增殖、凋亡、细胞周期及药物敏感性的变化：CCK-8法检测细胞增殖及其对去甲氧柔红霉素及高三尖杉酯碱药物敏感性的变化,通过流式细胞术检测细胞周期及凋亡,Q-PCR检测凋亡相关基因及Notch1、Hes-1的相对表达量,Werstern Blot检测Notch1、Cleaved Notch1及Hes-1的表达；5.不同浓度ADAM10抑制剂GI254023X作用于HEL后,CCK-8法及流式细胞术检测细胞增殖及凋亡,Q-PCR检测凋亡相关基因及Notch1、Hes-1的相对表达量,Western Blot检测Notch1、Cleaved notch1及Hes-1的表达.
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