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【目的】卡那霉素和妥布霉素广泛用于畜禽治疗肺炎,乳腺炎和腹泻等疾病的治疗,但是其具有潜在的肾毒性、耳毒性,对人类的健康存在危害。欧盟以及我国均制定了牛奶样本中卡那霉素的最低残留限量(Maximum residue limits,MRLs)为150μg/kg。尽管并没有针对妥布霉素的MRLs,但是因其潜在的毒性作用,监控其在牛奶中的含量十分必要。因此,建立简便、快速的分析方法检测动物源食品中的卡那霉素和妥布霉素含量,具有重要的现实意义。【方法】采用EDC法合成卡那霉素完全抗原以及HRP-Kan,并免疫抗原免疫Balb/C小鼠;将SP2/0与小鼠脾细胞融合,筛选并制备单克隆细胞株;制备AuNPs/HRP-Kan多标记纳米信号标签;基于AuNPs/HRP-Kan,建立直接竞争性酶联免疫分析方法(direct competitive immunoassay,dcELISA),并对方法的理化条件进行优化;利用构建的新方法检测牛奶样本中的卡那霉素和妥布霉素。【结果】本研究制备了能够同时识别卡那霉素和妥布霉素的单克隆抗体,其对二者的交叉反应率为100%和99.07%;以纳米金颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)为载体,成功合成多标记纳米信号标签AuNPs/HRP-Kan;通过优化反应条件发现,对于常规dcELISA和基于AuNPs/HRP-Kan的dcELISA,最适pH分别为6.8和7.4,且蛋白含量为0%时方法的灵敏度最佳;常规dcELISA中缓冲液的NaCl含量低于2%时,不影响方法的灵敏度,而基于AuNPs/HRP-Kan的dcELISA则不能耐受NaCl;基于优化的反应条件,构建了基于AuNPs/HRP-Kan的dcELISA,最低检测限为0.022 ng/mL,相比常规dcELISA提高了5倍(0.13 ng/mL);对牛奶样本中的添加回收实验显示回收率较为满意(卡那霉素,81.0-121.0%;妥布霉素,86.4-123.9%);对市场中在售的5种纯牛奶样本进行了检测,发现卡那霉素/妥布霉素的含量在0.352-0.548 ng/mL,远低于MRL。【结论】基于AuNPs/HRP-Kan的dcELISA简便宜行,能够为动物源食品中兽药残留物的检测提供灵敏、快速的分析方法。