【摘 要】
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目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和Cla酶切后的pLVTHM载体(含H1启动
【机 构】
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南京医科大学第二附属医院消化医学中心 江苏南京 210011
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目的:构建Smad4基因RNAi慢病毒载体。方法:针对已经筛选确定的Smad4基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和Cla酶切后的pLVTHM载体(含H1启动子和绿色荧光蛋白(GFP))连接产生LV-shSmad4慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-shSmad4, pCMV-dR8.74和pMD2G三质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果: PCR和测序证实,成功构建Smad4shRNA的慢病毒载体LV-shSmad4。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为5×10<10>pfu/L。结论:成功构建人Smad4基因RNAi慢病毒载体。
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