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新霉素(NEO)是由新霉素链霉菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，具有抗菌谱广的特点，被广泛用于治疗畜禽细菌性感染。但是，新霉素对人和动物有潜在的耳毒性和肾毒性，在相关动物源性食品中的残留威胁着人类健康。本研究应用EDC法将NEO分别与KLH、BSA、OVA偶联，紫外吸收法测得其蛋白浓度分别为2.39mg/mL、2.12mg/mL，和3.13mg/mL。以偶联产物二次免疫小鼠后，小鼠血清效价达1：3200，并在竞争试验中表现出良好的阻断作用。以NEO-KLH和NEO-BSA作为免疫原，NEO-OVA作为检测原，应用杂交瘤技术获得3株ELISA效价高的单克隆细胞株，分别命名为11B5、3B1和10H7。以辛酸饱和硫酸铵法和Protein G Resin对单克隆抗体进行纯化，3株单克隆抗体间接竞争ELISA的IC50分别为2ng/mL、6ng/mL和18ng/mL，均属IgG1亚类，与其他氨基糖苷类抗生素交叉反应均小于0.01％。以11B5单克隆抗体包被酶标板，配合NEO-HRP建立直接竞争ELISA法，方阵试验确定抗体工作浓度为1：800，NEO-HRP工作浓度为1：16000。标准曲线显示该方法线性检测范围是0.5～7.5ng/mL，R2达0.9949，IC50=1.645ng/mL在牛奶样品中分别添加终浓度为10ng/mL、50ng/mL和100ng/mLNEO标准品，通过直接竞争ELISA检测并结合标准曲线得出其回收率分别为80.5l±12.38％、87.00±7.73％、68.73±2.25％，变异系数分别为10.41％、8.88％、3.27％。通过检测大量人工样品的检测，确立检测限(LOD)和和定量限(LDM)分别为7.12ng/mL和29.2μg/Kg。在对300份用新霉素治疗奶牛临床乳房炎的奶样检测中，直接竞争ELISA检出的超过国家规定的最高残留量(500μg/Kg)的样品为232份，而气质联用(GC/MS)法检出238份，两种方法的符合率高达97.5％。