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精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)是存在于甲壳类中的泛过敏原,能够引起免疫球蛋白(Ig)E介导的Ⅰ型超敏反应.本研究旨在对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)AK的抗原表位进行定位分析,并探究其在酪氨酸酶(tyrosinase,Tyr)催化交联后致敏性的变化.以纯化的兔抗拟穴青蟹IgG为靶蛋白对噬菌体随机十二肽库进行生物淘选,得到20个对靶蛋白具有高度亲和性的模拟肽段,并通过测序得到5个肽段序列.利用LocaPep软件分析淘选出的肽段, 模拟得到4个构象表位C-AK-1 (D3A4K43M1A5T49T44I7)、 C-AK-2(L31K33V35T32E11E18F14S34D37)、C-AK-3 (V177G172M173Di76Q178T174L181K175L187)和C-AK-4(R202L170Y203E190P205W204L187T206Y145),以及关键氨基酸依次为D3,K33,T174和W204.根据噬菌体展示淘选结果,设计合成重叠肽段并利用甲壳类患者血清检测合成肽的免疫活性,得到6个具有IgE结合活性的肽段,进一步通过肥大细胞(RBL-2H3)的脱颗粒实验验证得到4个线性表位(AA: 113-127、127-141、141-155和204-218).利用甲壳类过敏患者血清对变性处理后AK免疫活性的测定结果表明,AK的致敏性依赖于其空间构象的完整性,存在于分子内部的二硫键Cys201-Cys271是影响AK致敏性的关键位点.在咖啡酸的参与下,利用Tyr催化热处理后的AK的交联反应,SDS-PAGE结果显示Tyr可有效地催化AK交联,产生大分子的AK交联产物(cross-linked ariginine kinase,CL-AK),抑制性ELISA检测AK交联后的半抑制浓度(IC50值)由1.13 μg/mL升高至228.36 μg/mL.通过Dot blot对CL-AK的免疫活性检测结果显示其IgG/IgE结合活性降低.利用RBL-2H3细胞模型验证CL-AK的致敏性,结果表明AK经交联处理后,刺激RBL-2H3细胞的组胺释放量和脱颗粒程度明显降低.进一步通过Balb/c小鼠模型比较CL-AK和天然AK在体内的致敏性,相比于天然AK组,CL-AK组小鼠血清IgE、IgG1含量分别降低92.3%和82.3%,血清中组胺含量下降55.73%,脾脏细胞释放的细胞因子IL-4,IL-13明显降低.这些结果为开发低致敏食品和预防治疗过敏性疾病提供了理论指导.