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犬瘟热(Canine Distemper, CD）是由犬瘟热病毒(Canine Distemper Virus, CDV)引起的一种传染性强、致死率高、多种动物共患的传染病。CDV通过信号淋巴细胞激活因子（Signalling Lymphocyte Activation molecular,SLAM）对宿主细胞的融合作用中最关键的就是H蛋白和F蛋白的相互作用，H蛋白吸附到细胞表面的受体上并协助F蛋白使CDV以囊膜与宿主细胞膜发生融合的方式进入宿主细胞。CDV感染宿主后,CDV H蛋白上与SLAM配体结合的关键区域是位于483-543位氨基酸中的22个氨基酸位点，研究这些区域对F蛋白融合的作用有利于了解CDV感染宿主时H与SLAM受体结合时起主要作用的位点从而对以后构建反向遗传疫苗奠定基础。 本研究主要内容包括：⑴选择高保真酶PrimeSTAR○RHS DNA聚合酶,用PCR技术以本实验室已经构建的pVAX-CDV3载体为模板扩增出CDV3的H基因和F基因。将扩增出来的DNA片段与质粒pcDNA3.1（+）连接，经过菌液PCR鉴定、质粒酶切鉴定、测序鉴定确定真核表达载体构建成功，将其分别命名为pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-F，用Takara质粒提取试剂盒提取足够的质粒放入-20℃保存，为后续试验奠定基础。⑵将pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-F用Lipofectamine TM2000共转染到Vero细胞中，用RT-PCR的方法检测目的基因mRNA在细胞中的转录作用。瞬时转染48小时后做间接免疫荧光试验，检测H蛋白表达用的一抗是抗CDV H蛋白的单抗，检测F蛋白表达用的一抗是犬源的CDV阳性血清，细胞分别在普通显微镜、共聚焦显微镜绿色荧光通道、红色荧光通道以及蓝色荧光通道观察。结果RT-PCR检测到目的基因转录，显微镜下观察到了合胞体，共聚焦显微镜下看到了H蛋白的绿色荧光，F蛋白的红色荧光，且融合后在一个合胞体上。⑶对质粒pcDNA3.1-H用定点突变试剂盒进行突变，成功的分别将526、527、528、529、547、548位氨基酸变为丙氨酸，分别命名为pcDNA3.1-H-526、pcDNA3.1-H-527、pcDNA3.1-H-528、pcDNA3.1-H-529、pcDNA3.1-H-547、pcDNA3.1-H-548。将突变的质粒分别转染到 Vero细胞中48小时后做间接免疫荧光试验查看突变后的 H蛋白表达情况，将突变的质粒与pcDNA3.1-F质粒进行共转染入Vero细胞和Vero-SLAM细胞中观察对细胞融合的反应，用Spss软件进行统计学分析。结果发现突变的H蛋白在细胞中都成功表达，突变前的质粒在Vero-SLAM细胞中形成的合胞体比在Vero细胞中的合胞体差异显著（P＜0.05），在两种细胞中526、529位氨基酸突变后合胞体与未突变相比显著变小（P＜0.05），合胞体缩小的程度在Vero-SLAM细胞中比在Vero细胞差异显著（P＜0.05）。本试验说明这两个位点在F蛋白启动融合中发挥着重要的作用。