羧酸酯酶(Carboxylesterases, CarEs)广泛分布于微生物、植物和动物体内,是重要的代谢解毒酶系。CarEs由多个基因编码,其基因的多样性决定了其功能的多样性。迄今为止,基于基因组测序技术,已有10种昆虫(包括黑腹果蝇,冈比亚按蚊,埃及伊蚊,尖音库蚊,家蚕,意蜂,丽蝇蛹集金小蜂,赤拟谷盗,豌豆蚜,温室白粉虱)CarEs数目被相继报道。CarEs在昆虫体内发挥着重要的生理作用,包括对外源有毒物质(杀虫剂或植物次生代谢物质)的降解,对信息素的代谢和神经发育的调控等。本课题组通过生物测定和生化水平的研究表明飞蝗(Locusta migratoria)田间种群对马拉硫磷产生了抗药性,揭示了CarEs活性提高和mRNA表达水平上调是导致飞蝗对马拉硫磷产生抗药性的主要原因。因此全面搜索飞蝗CarE基因并开展其分子特性及杀虫剂解毒功能研究,对揭示飞蝗对杀虫剂的解毒机制及抗性机理具有重要意义。本文主要研究内容如下：一、飞蝗CarE基因cDNA序列的转录组分析本文基于飞蝗转录组数据库,全面搜索飞蝗CarE基因,采用生物信息学方法分析获得84个飞蝗CarE基因片段,经ORF分析鉴定了39个CarE基因全长序列。系统进化分析显示,71个CarEs分布于如下5个功能簇中,其中A簇为直翅目昆虫α酯酶(45个CarEs,其中包括20个全长CarEs)、D簇为表皮特异酯酶(6个,3个全长CarEs)、E簇为β酯酶(17个,13个全长CarEs)、F簇为非鳞翅目保幼激素酯酶(1个全长CarEs)、I簇为未知功能酯酶(2个全长CarEs)。通过ExPASy在线软件分析39个CarE基因cDNA全长序列推导的氨基酸序列理化性质并预测其氨基酸保守位点,结果显示：39个飞蝗CarEs的分子量为52.2-92.6 kDa。大部分CarEs的等电点偏酸性或弱酸性,pI为4.24-6.95。28个飞蝗CarEs具有N端信号肽序列和N糖基化位点。本文研究发现：大部分飞蝗CarEs具有维持其正常的生理功能必需的保守位点,34个CarEs具有保守的催化三联体(Ser-Glu/Asp-His; S-E/D-H)结构。二、飞蝗CarE基因发育阶段和组织特异性表达基于飞蝗CarEs分类结果,采用RT-qPCR法检测8个基因(A簇4个、D簇、E簇、F簇和I簇各1个)在飞蝗不同发育阶段和不同组织部位的表达特性。RT-qPCR结果显示：所检测的8个基因在飞蝗各个龄期均有表达。除LmCesI1外,其余基因在若虫期和成虫期高表达,在卵期表达较低。组织分布和原位杂交结果显示：LmCesA1和LmCesA2主要在胃盲囊中表达；LmCesA20, LmCesD1和LmCesI1主要在肌肉和血液中表达;LmCesA3和LmCesEl主要在脂肪体和马氏管中表达; LmCesFl在前肠、后肠和脂肪体表达量最高,在胃盲囊和中肠中的表达量最低。三、溴氰菊酯对飞蝗CarE基因表达的影响溴氰菊酯是一种杀虫效力高、杀虫谱广、药效迅速、对作物安全的拟除虫菊酯杀虫剂。因此,分析溴氰菊酯对飞蝗CarE基因表达的影响,可对飞蝗防治中抗药性风险的评估提供基础资料。本文采用不同剂量溴氰菊酯处理三龄飞蝗若虫,RT-qPCR技术分析飞蝗CarE基因在溴氰菊酯不同浓度和不同处理时间后的mRNA表达特性。结果显示：5个CarE基因LmCesA1、LmCesA3、LmCesD1、LmCesEl和LmCesI1可被溴氰菊酯诱导,表明这些基因可能参与飞蝗对溴氰菊酯的代谢解毒及抗药性的产生。四、CarE基因沉默后飞蝗对杀虫剂的敏感性分析采用RT-qPCR技术检测飞蝗注射CarE基因特异的双链RNA (dsRNA)后,不同时间点(12 h、24 h和48 h)mRNA的相对表达量。结果显示：与对照组相比,LmCesAl mRNA表达量仅在24 h和48 h分别下降了87%和86%;LmCesA2仅在24 h表达量显著下调,沉默效率为97%；LmCesFl在12h和24 h的沉默效率显著。8个基因均在24 h有显著的沉默效果,沉默效率达70%以上,因此本文选择dsRNA注射24 h后进行杀虫剂生物学测定实验。目的基因沉默后观察飞蝗对杀虫剂的耐受性,结果显示：LmCesA20和LmCesEl被沉默后,导致飞蝗二龄若虫对马拉硫磷的敏感性提高。LmCesA1和LmCesA2沉默后,二龄飞蝗若虫对毒死蜱的敏感性增加。研究结果进一步表明飞蝗部分α酯酶和β酯酶也参与了有机磷类农药的代谢解毒。LmCesF1和LmCesI1沉默后,飞蝗对西维因的敏感性提高,表明这两个基因可能参与了飞蝗对西维因的代谢解毒。五、转基因果蝇品系的构建及其对杀虫剂敏感性研究采用Gal4/UAS系统,成功构建了转P20-LmCesA2纯合果蝇品系。杀虫剂生测实验表明：与亲本attP40和亲本果蝇attp40×Gal4杂交子一代果蝇相比,转基因果蝇杂交后代对马拉硫磷的耐药性提高,LDso比值分别为1.14和1.23倍。这与RNAi结合杀虫剂生测实验结果一致。表明LmCesA2极有可能参与飞蝗对马拉硫磷的代谢解毒。该基因在飞蝗体内的超表达可能会提高飞蝗对马拉硫磷抗性产生的风险。六、飞蝗CarE基因的真核表达本文通过基因克隆将目的基因LmCesA2克隆到表达载体FastBacHTA质粒中,将该重组载体pFast BacTM-LmCesA2转化到DH10Bac感受态细胞中,获得Bacmid-LmCesA2重组病毒DNA,并通过脂质转染法将其转染到sf9细胞中,获得重组病毒。Western-blot检测结果显示：sf9细胞质中检测到一条大小为60 kDa的蛋白特异条带,与预测的重组蛋白大小一致,表明飞蝗LmCesA2已在sf9细胞中成功表达。综上所述,本文基于飞蝗转录组数据库获得84个CarE基因cDNA序列,其中39个全长序列。对71个CarE基因系统进化分析结果显示,飞蝗CarE基因扩增发生在A簇和E簇。采用RT-qPCR法分析了8个CarE基因在飞蝗不同发育阶段及组织部位表达特性及溴氰菊酯对其mRNA表达的影响；RNAi结合生物学测定实验显示,不同飞蝗CarE基因可能参与了不同杀虫剂的代谢解毒,如：LmCesA20和LmCesEl与马拉硫磷的代谢解毒有关、LmCesAl和LmCesA2参与毒死蜱的解毒,而LmCesF1和LmCesI1对西维因代谢解毒有贡献；建立了转飞蝗CarE基因果蝇品系,探讨了该转基因果蝇品系对杀虫剂的耐药性；此外构建了飞蝗CarE基因的真核表达体系,在sf9细胞中成功表达了LmCesA2。本文研究结果将为深入开展飞蝗CarE基因的生理生化特性及农药代谢解毒机理提供基础资料,为飞蝗的杀虫剂抗性风险评估提供科学依据。