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漆树酸（Anacardic acid, AA)是一种从传统中药材收敛两翼木中提纯天然化合物，研究表明它具有抗肿瘤活性。然而，漆树酸抗肿瘤作用的祀点尚不明确。我们发现，漆树酸能够诱导人肝癌细胞HepG2和人骨髓瘤细胞U266调亡，是一种有效的内质网应激的诱导剂。漆树酸可以浓度和时间依赖增加HepG2和U266细胞中内质网应激信号通路中关键分子的表达，葡萄糖调节蛋白（glucose-regiilated protein, GRP)78、磷酸化的真核翻译起始因子2的a亚单位（eIF2a)、活化的转录因子4(ATF4)和生长停滞及DNA损伤基因153(CHOP/GADD153)；小分子干扰RNA (siRNA)沉默ATF4的表达可以部分逆转漆树酸诱导的细胞调亡，沉默CHOP/GADD153的表达则会加重细胞的死亡；漆树酸能够在体抑制HepG2细胞异种移植瘤的生长，并诱导裸鼠肿瘤组织产生内质网应激。以上结果表明漆树酸能够通过诱导ATF4依赖的内质网应激引起肿瘤细胞调亡。方法与结果1、MTS法检测细胞生长抑制率用MTS (购于美国Promega公司）法检测细胞生长抑制率⑴。取对数生长期的细胞，按2500个细胞/lOOmL接种于96孔板，总体积lOOul。细胞贴壁24小时之后更换培养基，按需要给予不同的药物处理相应的时间，每孔加入20ul的MTS,在37DC温箱里继续經育3h，用酶标仪(Sunrise, Tecan)读取每孔的光密度值（OD=490nm)。溶剂对照组作为对照，计算药物对细胞生长的抑制率（IR)，IR=(1-给药组吸光度值/对照组吸光度值）xlOO。/。，实验重复3次。结果证实漆树酸浓度和时间依赖性抑制HepG2和U266细胞的增殖。2、克隆形成实验克隆形成实验的实验方法如前所述[2]。将药物处理12h的HepG2和U266细胞重悬在含30%琼脂糖、20%的胎牛血清和50%RPMI-1640培养基的6cm dish中，在37°C含5%C02的培养箱中培养7天，用0.3%结晶紫染色后在光学显微镜下计数，实验重复3次。结果表明漆树酸完全抑制HepG2和U266细胞的集落形成。3、流式细胞仪检测细胞调亡通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC和PI双染的细胞调亡情况。将HepG2、U266和16HBE细胞离心收集后用PBS洗两次，再用结合缓冲液重悬后加入AnnexinV-FITC和PI，4奶1光經育15min-30min内流式细胞仪检测分析。结果发现HepG2和U266细胞中Annexin V-FITC和PI双染的细胞数明显增多，而16HBE细胞中Annexin V-FITC和PI双染的细胞数没有明显变化。表明漆树酸能够诱导肿瘤细胞调亡而对正常细胞诱导调亡不明显。4、细胞调亡的形态学变化用活细胞动态显微镜拍照，观察药物处理后Annexin V-FITC和PI染色的HepG2和U266细胞形态改变，双染的阳性细胞数明显增多，并有典型细胞调亡的形态学改变。5、siRNA的转染为了沉默CHOP或ATF-4在HepG2和U266细胞中的表达，用Lipofectamine2000做载体将干扰RNA转入细胞中，6h后换培养基。结果表明，漆树酸诱导的HepG2和U266细胞调亡中，CHOP不是最关键的调节分子，而ATF4依赖的内质网应激起了重要的作用。6、裸鼠荷瘤实验的建立SPF级雄性、5周龄的Balb/c裸鼠购于广东省动物中心并按照SPF级词养。以IxlO6个细胞/只在裸鼠的左侧背部皮下接种HepG2细胞，当肿瘤体积达50-75^mm时随机分成两组（每组6只），荷瘤裸鼠分别用对照溶剂和漆树酸（2mg/kg/day)给药14天。游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，肿瘤的体积=长度/2X宽度2。比起对照组来，给药组肿瘤体积被抑制了68%，肿瘤体重被抑制了41%。两组体重没有明显的差异。免疫组化发现漆树酸可以上调BiP、CHOP、ATF4和活化的Caspase-3的表达。结果说明漆树酸可以在体内诱导内质网应激并抑制肿瘤生长。7、蛋白印迹实验蛋白印迹实验的方法如前所述[3]。具体步骤是：给药后处理细胞、裂解细胞、提取总蛋白，测蛋白浓度，调成一致的浓度，每孔上相同的蛋白量，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转到PVDF膜。5%脱脂牛奶在室温經育Ih，一抗4°C經育过夜，PBST洗膜3次，加入二抗室温經育Ih。再用PBST洗膜3次，使用增强化学发光（ECL)试剂盒通过X射线胶片曝光显影。结果表明，HepG2和U266细胞经漆树酸处理后，不仅可以诱导GRP78/BiP和CHOP的表达，这与之前的报道一致[4]，而且还剌激磷酸化的eIF2a和ATF4的表达增加。结论漆树酸能够在体内外诱导人肝癌细胞HepG2和人骨髓瘤细胞U266调亡，这一作用与部分诱导ATF4依赖的内质网应激有关。