树突状细胞(Dendritic cell, DC)是宿主机体先天免疫系统中的一员,它是一种高效的抗原提呈细胞,可感知和捕获外界刺激,决定宿主是否启动免疫防御以及启动何种免疫防御,DC对机体免疫反应的调节可通过一定的信号通路。调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg )是一种免疫抑制细胞,在平衡免疫反应和免疫耐受中发挥关键作用,其稳态可以受到DC的调节。但具体通过怎样的分子途径仍然未知。本研究利用PKA调节亚单位R1αf/f小鼠模型和Cbl-b-/-C-cblf/f小鼠模型,构建了R1α和Cbl-b/C-cbl在DC细胞中条件性敲除小鼠,结果证实,DC中cAMP/PKA信号通路和Cbl信号通路均在其调节Treg稳态中发挥作用,并在此基础上深入研究cAMP/PKA信号通路在DC中的作用,及其调节Treg稳态的机制。1 cAMP/PKA和Cb1信号通路均参与树突状细胞对调节性T细胞稳态的影响为研究DC影响Treg稳态可以通过哪条信号通路,我们利用实验室现有R1αf1f小鼠模型和Cbl-b-/C-cblf/f小鼠模型,构建了他们在DC细胞中的敲除小鼠。DC敲除R1α,PKA中R亚单位失去了对C亚单位的抑制,从而模拟了 cAMP/PKA信号通路的激活。敲除小鼠的DC在淋巴结和脾脏中均出现显著性增殖,脾脏的DC甚至出现了一群特殊的MHCⅡhiCD11clow DC,由于跟淋巴结中迁移DC相似,我们称之为S2DC。DC中敲除Cbl-b/C-cbl,尽管敲除小鼠脾脏中cDC的比例和数量没有变化。但CD8+DC和CD11b+DC的比例却发生了逆转:WT小鼠CD8+DC & CD11b+DC比例大约为2: 7;而cbl-b-/-C-cbIDCKO小鼠的比例则正好相反,几乎为7: 2。更重要的是,这两种敲除小鼠淋巴器官中的Treg均出现显著性增殖。这说明cAMP/PKA信号通路和Cbl信号通路在DC细胞在调节Treg的稳态中均发挥一定作用。2 cAMP/PKA信号通路在树突状细胞中激活对其自身发育和功能的影响病原菌的感染与宿主免疫密不可分。我们以R1αDCKO小鼠为工具,着重研究了cAMP/PKA信号通路在DC调节Treg稳态中的机制。在病原引起宿主免疫防御的研究中具有一定意义。上一章的研究已经发现,小鼠的DC细胞中cAMP/PKA信号通路激活,会导致DC细胞在淋巴器官内聚集,与此同时,敲除小鼠的Treg也在淋巴器官内出现了广泛性增殖。这说明cAMP/PKA信号通路在DC细胞调节Treg的稳态中发挥一定作用。本章旨在研究cAMP/PKA信号通路在DC中激活对其本身发育和功能的影响。由于R1αDCKO小鼠淋巴器官中的DC增殖,而淋巴器官中DC的来源可能有2种,一是在骨髓发育中产生,通过血液循环到达淋巴器官;二是外周非淋巴器官的DC通过淋巴管道迁移至淋巴器官。我们首先发现,骨髓中DC的前体细胞preDC在WT和R1αDCKO小鼠中无显著性差别。另外,体外FLT-3L培养DC在WT和R1αDCKO小鼠中也无显著性差别,这说明DC增殖的原因并不是因为其在发育过程中生成的更多。外周非淋巴组织中的DC在收到诸如炎症等“危险信号”后,会向淋巴器官移动。在这个过程中,DC成熟,趋化因子受体CCR7的表达量会升高。这说明CCR7在DC迁移功能中具有关键性作用。经流式细胞检测,R1αDCKO小鼠皮肤cDC比例下降至WT小鼠的1/3,同时,皮肤和脾脏中CCR7的表达量都显著性高于WT小鼠。提示cAMP/PKA信号通路激活可能模拟了 DC受到“危险信号”,因此上调CCR7的表达,从而使得大量的外周非淋巴组织中DC迁移至淋巴器官,并聚集于此,脾脏甚至形成S2DC。3 R1α基因敲除小鼠的树突状细胞可通过cAMP/PKA信号通路影响调节性T细胞的稳态上一章已经证实DC中活化cAMP/PKA信号通路,可上调趋化因子受体CCR7的表达使得外周非淋巴组织的DC大量向淋巴器官聚集。本章旨在研究DC是如何影响Treg增殖的,是直接调节还是间接调节?以及这个调节与信号通路cAMP/PKA之间的关系。我们首先观察到R1αDCKO小鼠具有高水平的IL-2的生成。而IL-2是Treg产生和增殖所需最重要的一种细胞因子。体内封闭IL-2的产生可以使R1αDCKO小鼠脾脏中增殖的Treg出现下降。这说明R1αDCKO小鼠脾脏中增殖的Treg依赖IL-2的产生。进一步研究发现R1αDCKO小鼠中过量的IL-2是由于CD4+T细胞产生过多引起的。而CD4+T细胞产生IL-2是由于受到了抗原的刺激。体外抗原提呈实验证实,R1αDCKO小鼠的S2DC具有更强的抗原提呈能力,从而刺激了相应的OTⅡCD4+T细胞分泌更多的IL-2。这是因为R1αDCKO小鼠的S2DC表达更高的MHCⅡ水平。MHCⅡ是DC提呈抗原给CD4+T细胞的必要分子结构。体外封闭S2DC的MHCⅡ表达可以抑制S2DC的抗原提呈能力,并抑制IL-2的产生。综上所述,DC中cAMP/PKA信号通路激活,如同受到“危险信号”指令,因此上调CCR7的表达,使外周非淋巴组织DC向淋巴器官迁移,使脾脏聚集了一群MHCⅡhiDC,这群DC有更强的抗原提呈能力,能够刺激CD4+T细胞产生更多的IL-2,引起Treg稳态失调,表现为大量的增殖。4生理状态下的树突状细胞可通过cAMP/PKA信号通路影响调节性T细胞的稳态DC除了在受到外界病原菌感染过程中可通过cAMP/PKA信号通路影响Treg稳态,在正常生理状态下也可以通过cAMP/PKA信号通路调节Treg。紫外线照射是一种正常的生理现象。它作为一种普遍的外环境刺激可影响抗原提呈细胞的功能。DC则是皮肤上最主要的抗原提呈细胞。研究证实,紫外线照射会影响皮肤DC在皮肤上的分布,从而影响下游的免疫反应,诱导活化Treg。这说明DC是可以影响Treg稳态的。本课题通过紫外线照射小鼠模型,成功模拟出了 DC迁移和Treg的增殖。有意思的是,紫外线照射引起DC的迁移是即刻发生的,而引起Treg的增殖则是需要时间的累积,这提示Treg的增殖可能是受DC迁移的影响而继发产生的。与此同时,体内适应性转移的Treg也可以在紫外线照射的小鼠模型中出现增殖,这说明DC是可以直接影响Treg稳态的。尽管DC可调节Treg近年来已被多种实验证实,然而具体调节的机制仍不清楚。机体感知外界信号需要通过一定的信号转导通路。经研究证实,紫外线照射皮肤,可刺激机体产生大量的前列腺素E2(pGE2)。pGE2是通过结合其在细胞膜上的G蛋白耦连受体EP传递信号刺激。而EP又在cAMP/PKA途径的上游,这提示紫外线照射产生pGE2是通过cAMP/PKA途径。为研究紫外线照射引起皮肤DC迁移,引流淋巴结Treg增殖是通过cAMP/PKA途径。我们在实验室建立的紫外线照射小鼠模型中封闭了小鼠体内pGE2的产生,发现受到紫外线照射增殖的Treg在封闭了 pGE2后得到了部分下降,这就第一次证明紫外线照射引起DC迁移和Treg的增殖是可以部分通过cAMP/PKA途径。5 (国内研究部分)猪链球菌2型转录调控因子Tran功能的研究猪链球菌2型是一种重要的人畜共患病病原。猪链球菌病的爆发不但给养猪产业带来巨大的经济损失,还可感染人类具有重要的公共卫生学研究意义。本课题以我国猪群中广泛流行的猪链球菌2型(SS2)猪源ZY05719株为研究对象,前期通过抑制性差减杂交鉴定出可能与SS2毒力相关的新型转录调控因子Tran,通过构建敲除突变株△tran,对该基因进行深入研究。结果表明与野毒株相比,敲除株生长速率缓慢,粘附能力减弱,斑马鱼毒力下降。此外,利用基因芯片的分析手段,进一步明确了tran在转录调控方面的功能。芯片结果分析表明tran基因的敲除导致细菌全基因组中的130个基因发生差异性表达,其中上调基因21个及下调基因109个,基因功能涵盖编码各类蛋白酶及核酸酶,ABC转运系统组分,热休克蛋白,ATP结合蛋白,膜蛋白等多种功能基因。芯片结果已被qRT-PCR验证。在所有发生差异性表达的基因中最主要是编码糖代谢有关的酶类和热休克蛋白家族,这提示Tran在调控细菌自身糖代谢和抵抗外界宿主环境应激能力方面具有重要作用。而这也被后续实验所证实。综上所述,tran不仅仅是毒力相关因子,且作为调控基因在整体调控网络层面对SS2致病力产生重要影响。猪链球菌感染宿主,可引起宿主先天性免疫和适应性的免疫反应。尽管其中的分子机制仍不清楚,但猪链球菌鉴定出来许多毒力因子都与感染中和宿主的相互作用有关。荚膜多糖CPS可以抵抗宿主免疫细胞的吞噬,是最重要的毒力因子。最近研究发现,猪链球菌表面的腺苷酸合成酶Ssads也可能是一种毒力相关因子。它可将宿主细胞中的核苷酸转化成腺苷酸。一旦腺苷酸在细胞内累计,可以与细胞表面的G蛋白耦联受体A2a结合,启动下游的cAMP/PKA信号通路,通路激活可抑制白细胞对细菌黏附的敏感性,降低氧化作用和溶酶体的功能,以此破坏宿主免疫系统。这说明猪链球菌2型感染感染宿主是可以通过宿主细胞cAMP/PKA信号通路的。