论文部分内容阅读
骨组织工程支架方面的研究中，当前支架材料均有各自不足之处，获得一种力学、生物学、形态学等方面均“完美”的理想支架材料是目前的研究热点。各种材料中以聚乳酸羟基乙酸（PLGA）为代表的有机高分子生物材料因其较好的可塑成形性、可降解吸收性以及良好的生物相容性等优点，应用最为广泛。而为了克服单纯PLGA材料支架机械强度不足、细胞吸附力弱、降解时间偏长等缺点，本研究期望通过向PLGA中加入具有细胞诱导吸附力强、机械强度较高、降解较快的β磷酸三钙（β-Tricalcium poosphate，β-TCP），在冷冻干燥（Freeze-drying，FD）技术制成的形状可塑壳聚糖/明胶内核外表面，采用静电纺丝（Electrospinning，ES）立体包覆PLGA/β-TCP纳米纤维，从而生产出宏观结构可塑、微观三维孔隙结构丰富、成骨细胞亲和性佳、降解时间适宜的新型复合材料支架。研究方法：1.分别以10组不同质量比的PLGA和β-TCP为溶质（质量比分别为10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10），以体积比为2：1的三氯甲烷/丙酮混合液为溶剂，配制成质量分数为12%的10组纺丝液。采用静电纺丝技术（电压12Kv，电极间距10cm）试制PLGA/β-TCP纳米纤维。制备出来的PLGA/β-TCP纳米纤维薄膜，采用接触角测量仪测定不同组份的纳米纤维亲水性，液体置换法测定孔隙率，1%胰酶浸泡降解法测定降解性，从而选取亲水性、孔隙率、降解时间各方面均衡的PLGA/β-TCP配料比例。并利用扫描电镜观查纤维薄膜的微观孔隙结构。2.以壳聚糖和明胶质量比为1：1的混合物为溶质，1%醋酸为溶剂，混匀后-80℃冷冻干燥，制备出外观质地均匀、富含三维多孔隙结构的内核载体（可根据实际需要修裁外型）。将该内核载体置于静电纺丝接受电极端，以质量比为7：3的PLGA/β-TCP复合纳米纤维喷涂包裹于外，制得最终成型的PLGA/β-TCP纳米纤维支架。3.根据相关国家标准和行业标准，采用体外细胞毒性试验（GB/T16886.5-2003）和溶血试验（YY/T0127.1-1993）评价成型PLGA/β-TCP纳米纤维支架生物安全性。4.酶消化法获取SD仔鼠原代成骨细胞，分别与壳聚糖/明胶支架、PLGA纳米纤维支架、PLGA/β-TCP纳米纤维支架进行体外孵育培养，短时间培养为30min、60min和120min三个时间点，共孵育稳定1天后，取出支架在无细胞血清培养基中再培养4d和8d。分别采用MTT（四甲基偶氮唑盐微量酶反应）法检测粘附于支架上的细胞新陈代谢活性，并利用扫描电镜（SEM）观察支架上细胞的细胞数量及生物学形态。结果：1. PLGA与β-TCP质量比为10：0、9：1、8：2、7：3的4组可制得纳米纤维，其余6组产物为细粉粒状物，无法制得具有连续性的纳米纤维，不能形成网状三维结构，因而不符合试验要求。2.在可制成纳米纤维的4组中，随着PLGA/β-TCP混合材料中β-TCP比例的增加，所得纳米纤维材料的亲水性能逐渐降低，孔隙密度逐渐增加，整体降解速度逐渐增快。故PLGA与β-TCP质量比为7：3时所获得的PLGA/β-TCP纳米纤维材料最为理想。3.细胞毒性实验表明该种成型PLGA/β-TCP支架无细胞毒性，溶血试验结果显示其溶血率小于5%，具有良好的血液相容性和生物安全性。4.培养30min、60min和120min后，MTT实验表明，共孵育同等时长时PLGA/β-TCP纳米纤维支架上粘附的成骨细胞吸光值最高，壳聚糖/明胶组次之，PLGA纳米纤维支架组最低。SEM观察到PLGA/β-TCP纳米纤维支架上粘附的成骨细胞数量最多，壳聚糖/明胶组次之，PLGA纳米纤维支架组较少。5.成骨细胞共孵育1d后，各组MTT值无统计学差异（p＞0.05），SEM照片显示各组中成骨细胞粘附良好，开始铺展生长。在4d和8d时，PLGA/β-TCP组MTT值均高于PLGA和壳聚糖/明胶组（p＜0.05）。SEM照片显示各组中成骨细胞状态良好，平铺层叠生长，可见细胞伪足向孔洞内部生长，开始迁移，且PLGA/β-TCP组中细胞数量明显多于PLGA和壳聚糖/明胶组。结论：采用质量比为7：3的PLGA/β-TCP混合纺丝液，利用静电纺丝技术可制得三维孔隙结构丰富、成骨细胞吸附性强、降解时间适宜的纳米纤维，辅以冻干法制备的壳聚糖/明胶可塑性内核，制得较为理想的PLGA/β-TCP纳米纤维支架。该支架具有可靠的生物安全性和良好的细胞相容性，同时还具有外型可塑性高，成骨细胞吸附性强，促细胞增殖能力佳，降解时间适宜等优点。