尖吻蝮(Agkistrodon acutus)又称五步蛇，隶属爬行纲(Reptilia)，有鳞目(Squamata)，蝰科(Viperidae)，蝮亚科(Crotalinae)，为剧毒蛇，其毒性与眼镜王蛇相当。相传人被咬伤，不出五步即死，故称五步蛇。尖吻蝮在我国分布较广，在东经104°以东，北纬25°到31°之间，其中以武夷山山区和皖南山区贮量最多。蝮亚科毒蛇的蛇毒中含有多种可影响血液系统的酶类，其中一种能抑制胶原、ADP、凝血酶和花生四烯酸等诱导的血小板聚集作用的磷脂酶受到广泛的关注。 磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)能够在磷脂甘油部分的磷脂酰基(sn—2)位点选择性断裂酯键，生成的产物为溶血磷脂和脂肪酸。在蛇毒中存在许多PLA2同工酶，它们之间的氨基酸序列同源性大于90％，结构也较为相似，但却具有不同的药理生理功能。 一.组分FⅩbb的分离纯化 本论文建立了简单有效分离FⅩbb的方法，安徽产五步蛇蛇毒经过三步分离程序得到。经DEAE Sephadex A—50阴离子交换层析初步分离，得到了10个蛋白峰。经酶活性定性检测，峰Ⅸ、峰Ⅹ有磷脂酶A2活性，峰Ⅹ比峰Ⅸ量多。选取峰Ⅹ进一步经Sephadex G—50凝胶过滤层析，得到三个蛋白峰，其中b峰具有磷脂酶A2活性；将其再经过Sephadex G—50分离纯化，得到2个蛋白峰，其中b峰具有磷脂酶A2活性。收集组分FⅩbb，透析脱盐、冷冻干燥。冷冻干燥后对该组分经SDS—PAGE电泳实验显示单一条带，分子量为16KD左右。1g粗毒经过三步分离程序最终得到单一组分FⅩbb34.8 mg，回收率为3.48％。 二.FⅩbb酶活的测定 底物的配制采用Martin等[55]的方法加以改进进行。PLA2酶活力用每毫克蛋白质每分钟释放出的脂肪酸来描述。酶活测定显示，FⅩbb酶活(37℃)为67μmol·min—1·mg-1，而粗毒酶活为26μmol·min—1·mg-1，酶活回收率超过100％，出现该现象的原因可能是：蛇毒是多种蛋白组分的混合物，各种不同的组分之间存在着相互竞争的关系，从而导致其中某些组分对酶活性的发挥起了抑制作用，使得酶的活力回收超过100％。 三.温度、pH、金属离子和EDTA对FⅩbb酶活性的影响 3.1温度、pH对FⅩbb酶活性的影响 测定了：在不同温度保温后的酶活性，该FⅩbb的最适温度在48℃左右，最适pH在8.5左右。FⅩbb在80℃保温15和30min后，酶活力降低，分别为75％和62％，结果表明此酶具有一定的热稳定性。FⅩbb在酸性环境下可以较为稳定的存在，基本不丧失活力。但是在pH>9的情况下，活力迅速减弱。 3.2金属离子和EDTA对FⅩbb活性的影响 结果显示：Ca2+、Na+、K+可增强酶活性，而Cd2+、Cu2+、Li+和Fe2+等对FⅩbb酶活性均有抑制作用。EDTA钠盐使酶活性几乎丧失，仅为5.7％。DTT对酶活性稍有影响，仍为69.2％， 四.FⅩbb蛋白水解活性的测定 用Azo—Casein(Fluka BioChemika)作为底物观察FⅩbb的酪蛋白水解活性[57-59]。Azo—Casein是蛋白水解酶的发色底物。Azo—Casein水解后产生可溶于三氯乙酸的有色组分，使反应液的A390值升高。结果：FⅩbb不能水解 Azo—Casein,且随着FⅩbb浓度的升高，反应液的A390值仍然接近为零，显示FⅩbb无蛋白水解活性。 五.胰蛋白酶对FⅩbb酶活力的影响 当FⅩbb与胰蛋白酶混和后在37℃水浴中保温10min后测定酶活力，结果胰蛋白酶对FⅩbb的酶活力的影响较大，以初速度计，酶活力只有原来的30％左右。说明FⅩbb没有抗胰蛋白酶的活性。 六.FⅩbb的类凝血酶活性测定 反应板法测定类凝血酶活性[52]。凝血酶(100U/ml)与牛纤维蛋白原溶液混合后，不到5s可立即抽出纤维蛋白丝，然后迅速凝固；FⅩbb(1 mg/ml)与牛纤维蛋白原溶液混合，10min后仍未有纤维蛋白丝出现，再加入凝血酶(100U/ml)后反应液不凝固，提示FⅩbb无类凝血酶活性。 七.FⅩbb的精氨酸酯酶活性测定 参照李书宽[53]的方法，以BAEE为底物，加入FⅩbb后，混合液在253nm处的吸光度值没有随时间而增加，说明FⅩbb不能水解精氨酸酯，不具有精氨酸酯酶活性。 八.FⅩbb对血小板聚集的抑制作用 通过比浊法测定[54]血小板的聚集率和聚集抑制率，用ADP、胶原、人凝血酶和花生四烯酸作为血小板聚集诱导剂，研究FⅩbb与血小板的相互作用。实验显示，FⅩbb可以抑制ADP、胶原、人凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集作用，对不同诱导剂的作用是不同的，其中以胶原对FⅩbb抑制作用最敏感。结果还表明，花生四烯酸对低浓度的FⅩbb抑制作用不敏感。提示FⅩbb对不同诱导剂在作用方面存在一定的差别。当阿司匹林30mg/ml时，可抑制FⅩbb对血小板的聚集作用。 小结： 1.安徽产五步蛇粗毒经过DEAE Sephadex A—50阴离子交换层析和两步Sephadex G—50凝胶过滤层析分离得到电泳纯的目的组分FⅩbb，分子量为16kD左右。 2.FⅩbb的最适温度在48℃左右，最适pH在8.5左右。具有一定的热稳定性。分子中的Ca2+是酶活性所必需的，二硫键对酶活性的维持起到一定的作用。 3.FⅩbb酶活(37℃)为67μmol·min-1·mg-1，而粗毒酶活为26μmol·min-1·mg-1，酶活回收率超过100％。不具有蛋白水解酶、抗胰蛋白酶、类凝血酶和精氨酸酯酶活性。 4.FⅩbb可以抑制ADP、胶原、人凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集作用，对不同诱导剂的作用是不同的，其中以胶原对FⅩbb抑制作用最敏感。