论文部分内容阅读
玉米大斑病(Exserohilum turcicum)是一种主要的世界性病害,严重爆发地区的感病品种减产可达50%左右,种植抗病品种是防治大斑病最经济、有效的措施。为培育抗病新品种,筛选鉴定抗病相关基因已成为有效防控玉米大斑病的重要研究任务。所以从基因水平上揭示玉米在大斑病菌侵染过程中可能参与抗病反应的相关基因并对抗病相关基因进行克隆与功能分析,可为抗病分子育种提供科学依据及优良的抗病基因资源。杨树灰斑病(Phyllosticta populea Sacc)是杨树主要病害之一,发生面积大且危害严重,目前已成为杨树人工林急待解决的问题。种植抗病品种是防治杨树灰斑病的最安全、有效的措施,但因抗病种质资源匾乏,极大地阻碍了杨树抗病品种的选育。杨树作为转基因的木本模式植物,采用转基因技术将外源抗病基因转入其基因组中是防治杨树灰斑病行之有效的方法。病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PRP)是植物在病原物入侵等逆境胁迫过程中诱导表达的一类蛋白质,其功能大多与植物抗病反应密切相关。随着对其生化性质、作用机理、表达调控的深入研究,用病程相关蛋白基因转化植株日益成为植物防御病害的有效途径。本研究以抗病玉米自交系C103HtN为植物材料,采用RNA-seq测序技术,构建玉米响应大斑病菌侵染的转录组文库。对差异表达基因进行分析,筛选抗病相关基因;并对差异表达病程相关蛋白ZmPR-1和ZmPR-4基因进行克隆与功能分析,明确它们在抗玉米大斑病、杨树灰斑病反应中的作用,探索病程相关蛋白ZmPR-1、ZmPR-4基因的功能特性。这将进一步丰富病程相关蛋白与植物抗病关系的研究,同时也为利用植物基因工程防治植物病害的新途径提供理论依据及优良的抗病基因资源。研究结果如下:(1)构建了 9个大斑病菌诱导下玉米转录组文库,共获得差异表达基因5903个,其中有3195个基因上调表达,2708个基因下调表达。差异表达基因GO和KEGG功能显著性富集分析结果显示:与玉米抗逆响应关系密切的主要有乙烯代谢途径(ethylene metabolic process)GO:0009692、诱导系统抗性/茉莉酸介导的信号通路(induced systemic resistance/jasmonic acid mediated signaling pathway)G0:0009864、水杨酸介导的信号传导途径(salicylic acid mediated signaling pathway)G0:0009863、MAPK 信号通路(MAPK signaling pathway)ko04010、植物-病原体相互作用(Plant-pathogen interaction)ko04626等。并对植物与病原相互作用的基因、植物抗逆境相关转录因子、植物激素相关基因和植物抗氧相关基因四类差异表达基因进行了表达模式分析。由此可见,大斑病菌诱发了玉米多种抗病信号通路及信号传导途径,暗示玉米响应大斑病菌侵染的分子机制受到多基因网络系统的调控。随机选择8个差异表达基因进行qRT-PCR验证,结果证明Illumina RNA-Seq测序结果是可靠的。(2)通过基因差异表达分析,从中筛选了一个PR-1基因进行克隆及功能分析。ZmPR-1基因cDNA全长开放阅读框为504bp,编码167氨基酸,ZmPR-1蛋白具有PR-1基因家族完整的SCP超家族保守结构域,同多种植物的PR1蛋白同源性极高。干旱、盐、大斑病菌及其代谢物均可显著诱导该基因表达。构建植物表达载体,对其进行烟草转化,获得14株阳性株系。阳性株系抗病性测定结果显示:ZmPR-1基因在转基因烟草中过量表达可提高其对玉米大斑病菌的抗性。抗性株系烟草叶片防御酶活性的测定结果显示:转基因烟草在玉米大斑病菌胁迫下其超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著提高。初步明确ZmPR-1基因具有抗玉米大斑病菌的功能。(3)通过基因差异表达分析,从中筛选了一个PR-4基因进行克隆及功能分析。ZmPR-4基因cDNA全长开放阅读框为492bp,编码163氨基酸,并在23和24个氨基酸之间有一个明显的信号肽结构。干旱、盐、大斑病菌及其代谢物均可显著诱导该基因表达。构建植物表达载体,对其进行烟草转化,获得7株阳性株系。阳性株系抗病性测定结果显示:玉米ZmPR-4基因在转基因烟草中过量表达可提高其对玉米大斑病菌的抗性。抗性株系烟草叶片防御酶活性的测定结果显示:转基因烟草在玉米大斑病菌胁迫下其SOD、POD和CAT活性均显著提高。初步明确ZmPR-4基因具有玉米抗大斑病菌的功能。(4)ZmPR1和ZwPR4基因在烟草中过量表达均提高了转基因株系对杨树灰斑病菌(P.populea Sacc)的抗病性。对抗性株系烟草叶片防御酶活性、总酚含量和丙二醛(MDA)含量进行测定,发现转基因烟草Nu-ZmPR-1、Nu-ZmPR-4在杨树灰斑病菌胁迫下显著提高了苯丙氨酸解氨酶(PAL)、POD、SOD和CAT活性,提高了总酚含量,而降低了 MDA含量。初步明确ZwPR-1、ZmPR-4基因对杨树灰斑病菌具有一定的抗性。