论文部分内容阅读
在逆境胁迫条件下,海藻糖(trehalose)可大大提高生物体的抗干旱、冷、高盐等非生物胁迫的耐受性。海藻糖-6-磷酸合酶/海藻糖-6-磷酸酯酶(TPS/TPP)途径是海藻糖合成的主要途径,广泛存在于古细菌、细菌、真菌、无脊椎动物、低等蕨类藻类植物和高等植物中。TPS/TPP途径中合成海藻糖的底物之一是尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG),而UDPG由尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)催化合成的。
本研究通过构建大肠杆菌otsA/B(海藻糖6-磷酸合酶/海藻糖-6-磷酸酯酶)融合基因和水稻尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶OsUgp2基因的共表达载体,转化水稻愈伤组织,获得相应转基因水稻植株,检测转基因植株在干旱、寒冷和高盐胁迫下的耐受能力,及其与otsAB,OsUgp2基因的表达量、代谢产物海藻糖含量的相关性。得到如下的实验结果:
1、从大肠杆菌DH5a基因组中分别克隆到otsA和otsB基因,并融合为otsAB基因;从实验室保存的含有OsUgp2 cDNA片段的重组质粒上亚克隆OsUgp2基因,进一步以1300G为骨架,构建表达载体1300AB,1300U。在此基础上,以1380载体为骨架构建分别由35S驱动的otsAB和OsUgp2共表达载体1380ABU。
2、将表达载体1300AB,1300U及共表达载体1380ABU分别转化水稻ZHll,PCR检测标记基因潮霉素(Hyg)筛选阳性植株。并且通过RT-PCR和Real-timePCR检测转基因植株外源基因AB,U的表达情况,在获得的转基因株系中,选用确认otsAB和OsUgp2有过量表达的株系ABU、AB和U,做后续的干旱、寒冷、高盐胁迫处理。
3、对转基因植株ABU,AB,U和对照ZHll进行干旱、24℃冷、150mMNacl高盐胁迫处理,结果分别如下:(1)干旱胁迫处理之后,转基因植株ABU和AB表现出比转基因植株U和对照ZHll较强的抗干旱的能力;(2)8-10℃冷胁迫处理之后,转基因植株ABU,AB,U和对照ZH11无明显的表型差异。但是,2-4℃冷胁迫处理之后,ABU和AB表现出比转基因植株U和对照ZHll较强的耐冷能力;(3)150mM Nacl高盐胁迫处理之后,转基因植株ABU,AB,U和对照ZHll表型无明显差别。
4、Real-time PCR检测转基因植株ABU,AB中otsAB,OsUgp2表达量显示各种胁迫处理之后otsAB,OsUgp2表达量都有提高。与ABU和AB耐冷、耐旱能力成正相关。
5、高效离子色谱检测转基因植株ABU,AB,U和对照ZHll经干旱、2-4℃冷、150mMNacl高盐胁迫处理后水稻幼苗中海藻糖、蔗糖含量的变化。结果显示各种胁迫处理之后,海藻糖的含量基本上都有所上升,但转基因材料ABU中海藻糖含量分别比AB和U中提高两倍多和五倍多,可见otsAB和OsUgp2共表达可以提高海藻糖的含量,同时也可以进一步提高植物的抗干旱、耐冷胁迫的能力。