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背景和目的：人类基因组计划完成以后，生命科学的研究进入了后基因组时代。蛋白质介导细胞的许多生物学活性，而且大部分蛋白质都是和其他蛋白质形成复合物来发挥作用。为了更好理解细胞的生命活动，必须很好了解蛋白质单体和复合物的功能，这就涉及到蛋白质相互作用的研究。蛋白质相互作用作为蛋白质组学的重要组成部分，已经成为了生物技术的一个重要领域。CTCF是广泛存在于真核生物的多功能转录调节因子，其基因定位于16q22.1，人CTCF蛋白质全长727个氨基酸残基，中段312个氨基酸残基形成11个连续锌指结构。CTCF通过11锌指结构形成不同的组合选择性识别多种DNA序列，通过与DNA靶位点结合发挥对多个基因的表达调控作用，具有启动子抑制和激活、基因沉默、增强子阻断、调控基因印迹、X染色体失活等多方面的功能。CTCF通过它的靶基因调控细胞生理的方方面面，在细胞生长、增殖、分化、凋亡、遗传、表遗传和肿瘤发生发展等各方面起着基础性的调节作用。
本室前期研究利用酵母双杂交系统以pGBKT7-CTCF为诱饵筛选人肝cDNA酵母文库，获得了与CTCF相互作用的人。vigilin同源酵母阳性克隆及其蛋白质编码基因。本研究采用表达GST融合蛋白质的方案，克隆、原核表达CTCF全长蛋白和N、Zn、C三个片段；用表达His融合蛋白质的方案，克隆、原核表达Vigilin-315和Vigilin-3KH片断；亲和层析纯化融合蛋白；用GST沉降技术检测CTCF及其片段和Vigilin片段间是否存在相互作用。
方法：编码CTCF全长序列的pGEM7Zf(-)-CTCF质粒由美国纽约州立大学W．W．Quitschke教授惠赠，以其为模板，分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn，pGEX-4T-2-CTCF-C，转化宿主大肠杆菌BL21并做双酶切和测序鉴定；优化IPTG诱导表达条件，诱导表达GST融合蛋白并经GSTrap FF亲和层析柱纯化得到GST融合蛋白CTCF，CTCF-N，CTCF-Zn，CTCF-C。将与vigilincDNA同源的315号克隆和经PCR扩增所得Vigilin 1-3KH序列插到原核表达载体pET28-a(+)，分别构建His融合表达重组质粒pET28a(+)-315，pET28a(+)-3KH，分别转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)，双酶切和测序鉴定，优化IPTG诱导表达条件；表达His融合蛋白并经HisTrap亲和层析柱纯化得到His融合蛋白Vigilin-315并进行Far-Western Blot鉴定。用CTCF及其片段GST融合表达的蛋白质为诱饵，利用GST沉降技术检测His融合表达的Vigilin-315片段是否与其存在相互作用。
结果：重组质粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn ，pGEX-4T-2-CTCF-C ，pET28a(+)-315 ，pET28a(+)-3KH，经双酶切和测序鉴定证实构建成功。GST融合蛋白CTCF，CTCF-N，CTCF-Zn，CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达，融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白；His融合蛋白Vigilin-315，Vigilin-3KH在大肠杆菌中成功诱导表达，融合蛋白Vigilin-315经亲和层析纯化、包涵体复性，获得纯化蛋白。GST沉降实验检测GST融合CTCF蛋白及其片段与His融合Vigilin315蛋白之间相互作用，结果显示GST融合的CTCF以及其三个片段均未与His融合Vigilin-315蛋白发生体外相互作用。
结论：成功构建了原核表达GST融合蛋白质粒pGEX-4T-2-CTCF，pGEX-4T-2-CTCF-N，pGEX-4T-2-CTCF-Zn，pGEX-4T-2-CTCF-C：及His融合蛋白表达质粒pET28a(+)-315，pET28a(+)-3KH。对融合蛋白表达条件进行了优化，获得了高效表达的GST融合蛋白CTCF，CTCF-N，CTCF-Zn，CTCF-C；及His融合蛋白Vigilin-315，Vigilin-3KH；并对上述蛋白进行了纯化。应用GST沉降技术对GST融合CTCF蛋白及其片段与His融合Vigilin片段蛋白之间相互作用进行鉴定，结果未检测到CTCF及其N、Zn、C片段在GST沉降实验中与Vigilin-315片段结合，结果表明在本实验条件下未发生蛋白质相互作用。