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骨质疏松症(osteoporosis)是以骨质量丢失、骨组织微观结构退变致使骨脆性增加并易于发生骨折为特征的代谢性骨病。随着年龄增加,男、女性均出现相对缓慢、与增龄相伴的骨丢失,即增龄性骨丢失,并出现老年骨质疏松(senile osteoporosis)。我国有近1亿骨质疏松症患者,伴随着我国步入老龄社会,老年性骨质疏松的发病率逐年升高,尤其在人口密集、老龄化明显的华南地区。深入探索增龄性骨丢失与老年性骨质疏松的发病机制,寻找有效的防治方案是亟待解决的科学问题。研究表明,随年龄增加,成骨细胞分化减少,寿命缩短,导致骨形成不足是增龄性骨丢失的重要原因。探索促进成骨细胞分化,延长成骨细胞寿命的新方案,对于防治骨质疏松具有重要意义。雷帕霉素机制性靶蛋白(mechanistic target of Rapamycin,mTOR)是整合细胞内外各种信号,调节细胞生长与代谢的中心信号分子。课题组前期研究中发现mTORC1在成骨细胞增殖与分化中起重要作用,但成骨细胞mTORC1在增龄性骨丢失中的作用与机制尚不清楚。目的:(1)研究成年后在成骨细胞中激活mTORC1,对小鼠增龄性骨丢失的影响。(2)探索mTORC1影响增龄性骨丢失的作用机制。方法:建立可诱导型成骨细胞特异敲除TSC1的转基因小鼠,在小鼠成年且骨密度达峰值(6月龄)后在成骨细胞中特异诱导敲除mTORC1上游阻遏基因TSC1(TSC1 OBKO)以激活mTORC1,于此小鼠12月龄时使用micro-CT技术检测;制作小鼠下肢石蜡切片,进行免疫组化和HE、BrdU和Tunel染色。使用雷帕霉素对MC3T3-E1细胞进行处理或以TSC1shRNA的慢病毒进行转染,而后利用免疫印迹、茜素红染色等技术观察mTORC1的活性对成骨分化的调控及可能机制。以免疫沉淀检测mTOR与成骨转录因子PAX5的相互作用。结果:(一)体内实验:(1)相对于同龄的Contro1小鼠,12月龄的TSC1 OBKO小鼠骨皮质增厚,差异具有统计学意义(P<0.05);骨松质骨密度增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)TSC1OBKO小鼠股骨松质骨中成骨细胞增殖增多且凋亡减少,差异具有统计学意义(P<0.05)(3)TSC1 OBKO小鼠的股骨松质骨组织中Osterix(OSX)阳性细胞增加。统计数据显示TSC1 OBKO小鼠OCN阳性成骨细胞显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)此外,TSC1 OBKO小鼠骨松质中破骨细胞数量减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。(5)敲除组及对照组小鼠成骨细胞中成骨关键转录因子Runx2均无阳性着色。然而,敲除组成骨细胞中成骨转录因子PAX5表达显著增强。(二)体外实验:(1)使用mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)可剂量依赖性抑制MC3T3-E1细胞的成骨分化。反之,稳定敲低TSC1以持续激活mTORC1则促进其成骨分化(2)进一步研究发现,MC3T3-E1细胞成骨分化中PAX5的表达随着细胞成骨分化的进程,逐渐上升。(3)雷帕霉素抑制PAX5的表达;反之,稳定敲低TSC1则促进PAX5的表达。(4)mTOR可与PAX5相互结合。结论:小鼠成年后,在成骨细胞中特异激活mTORC1能有效抑制增龄性骨丢失;mTORC1通过促进中老年期小鼠成骨细胞增殖与分化,从而增加骨形成;mTORC1调控成骨细胞分化的途径可能与PAX5有关。