【摘 要】
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丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)是细胞能量代谢的核心枢纽,能够催化糖酵解产物丙酮酸,脱羧生成乙酰辅酶A,该产物是进入三羧酸循环(TCA)的初始底物,
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丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvate dehydrogenase complex,PDC)是细胞能量代谢的核心枢纽,能够催化糖酵解产物丙酮酸,脱羧生成乙酰辅酶A,该产物是进入三羧酸循环(TCA)的初始底物,最后通过氧化磷酸化为机体供能。而在整个复合物中,丙酮酸脱氢酶是关键限速酶。因此弄清楚丙酮酸脱氢酶及其与二氢硫辛酸转乙酰基酶间的相互作用机制至关重要。本文首先通过克隆大肠杆菌丙酮酸脱氢酶(E1)的N端结构域(ntd)、二氢硫辛酸乙酰基转移酶(E2)的外周结合结构域(psbd)等基因,利用原核表达系统表达并纯化得到NTD,PSBD等相关蛋白质,进而直接在体外利用pull down和等温滴定量热(ITC)的方法研究二者间的相互作用。最后,通过核磁共振技术研究NTD的溶液结构及它与PSBD复合物的溶液构象,探索E1和E2的作用机制。实验中取得的结果列举如下:(1)通过原核表达载体构建和蛋白质表达纯化,获得带HIS标签的NTD、E1、E56和切除标签的PSBD、HPSBD、LIPO等6个蛋白质,且根据质谱鉴定结果表明其全部为表达正确的目的蛋白质。(2)运用pull down和ITC技术进行蛋白质体外相互作用研究显示:PSBD只能与E1的NTD结合;LIPO既不与NTD结合也不与PSBD互作,排除了其参与E1、E2间相互作用的可能;HPSBD不同于PSBD,不能与NTD结合;还通过ITC实验比较了PSBD分别与NTD、E1相互作用的热力学差异。(3)利用圆二色谱(CD)和动态光散射(DLS)方法研究了PSBD在不同溶液中动态构象变化,表明PSBD结构易于变化,非常容易从折叠态转化为不和E1、E3结合的无规卷曲态,它的这种构象转化为它与E1、E3结合的相互转化提供了结构基础。(4)通过NMR手段完成对NTD蛋白的溶液结构解析,其三维结构由两股?-螺旋和无规卷曲组成,根据PROCHECK等软件的评估显示,NTD的NMR结构有很高可靠性,对于PSBD和NTD的复合体结构解析尚未完成。以上结果在揭示E1与E2的相互作用机制方面提供了结构基础和理论依据,也为针对有关二者互作面的抗生素类药物设计提供思路。
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