原小檗碱类生物碱包括小檗碱、黄连碱、药根碱、氯化两面针碱、小檗红碱等,药理作用广泛,临床常用于抗菌、消炎、镇痛、降糖等。小檗碱、药根碱、黄连碱等活性成分可由多年生草本植物黄连、三角叶黄连等植物根茎提取,氯化两面针碱(Nitidine Chloride, NC)是从药用植物两面针Zanthoxylum nitidine (Roxb) DC根中分离得到的生物碱。现代研究证明,NC具有抗肿瘤、抗炎镇痛等药理作用,尤其在抗肿瘤方面,由于其抗瘤谱广,对肺癌、口腔鳞癌、肝癌等许多恶性肿瘤具有较强的抑制作用,具有潜在的开发价值和应用前景。有机阳离子转运体(organic cation transporters, OCTs),包括OCT1,OCT2和OCT3,在体内主要负责转运小分子有机阳离子或中性化合物,包括内源性化合物和一些外源性底物。人肝脏表达OCT1,OCT3,而肾脏则表达OCT2。原小檗碱类生物碱为含氮的叔氨或季氨生物碱,在生理pH7.4的条件下以阳离子或中性化合物的形式存在,因此,推测肝细胞膜上的OCTl及OCT3,肾细胞膜上表达的OCT2可能介导这类生物碱在肝、肾细胞的摄取。为深入了解OCTl,OCT2和OCT3在这类生物碱肝、肾细胞处置中的作用,并考察由此引起的体内外毒性,本研究首先考察该类生物碱与OCT1/OCT2的相互作用,进而选择氯化两面针碱(NC),采用多种转基因细胞模型、人肝脏微粒体、人重组CYP酶及整体动物模型,研究由转运体OCTs介导的NC跨膜转运、肝细胞中CYP450介导的代谢、药代动力学特征及其体内外毒性,进一步阐明细胞膜药物转运体、药物代谢酶等在NC体内外毒性中的作用,并进行体内外毒性的相关性分析,为NC的进一步研发提供参考。第一章有机阳离子转运体1,2与原小檗碱类及类似生物碱相互作用研究背景和目的：原小檗碱类生物碱为叔胺或季铵化合物,在生理pH 7.4条件下以阳离子或中性化合物存在。肝脏、肾脏细胞基底膜上的有机阳离子转运体1和2(OCT1和OCT2)主要负责转运小分子有机阳离子及中性化合物。基于原小檗碱类生物碱的化学结构,及OCT1/OCT2的肝肾分布,本章主要研究原小檗碱类及类似物生物碱与OCT1/OCT2的相互作用。方法：应用稳定高表达人有机阳离子转运体1或2(hOCT1, hOCT2)和空载体(mock)细胞(MDCK-hOCT1, MDCK-hOCT2和MDCK-mock)模型,采用细胞积聚方法,阐明原小檗碱类及类似生物碱,包括小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗红碱、氯化两面针碱、巴马汀、延胡素甲素、(-)-延胡素乙素((-)-THP)对OCT1/2经典底物的抑制作用,进一步考察其在稳定转染hOCT1, hOCT2细胞上的积聚与mock细胞上积聚的差异,以阐明其是否为OCTs底物。此外,为阐明OCTs基因多态性对该类生物碱摄取的影响,本研究选择小檗碱和黄连碱,考察其在MDCK-OCT1-P341L和MDCK-OCT2-A270S细胞上积聚与表达野生型OCT细胞上积聚的差异。结果：本研究考察的生物碱均能显著抑制MPP+在MDCK-hOCT1/ MDCK-hOCT2细胞上的摄取,且抑制作用不亚于阳性抑制剂(OCT1：奎尼丁；OCT2：西咪替丁)。细胞摄取研究表明,小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、氯化两面针碱及小檗红碱在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT2细胞中的积聚明显高于mock细胞,细胞摄取动力学研究显示,在MDCK-hOCT1细胞上,上述生物碱Km大小顺序为：黄连碱>药根碱>表小檗碱>小檗碱>小檗红碱>氯化两面针碱,Vmax依次为：黄连碱>表小檗碱>药根碱>氯化两面针碱>小檗红碱>小檗碱,Clint依次为：氯化两面针碱>小檗红碱>黄连碱>表小檗碱>小檗碱>药根碱；而在MDCK-hOCT2细胞上,上述生物碱的Km为：小檗红碱>表小檗碱>小檗碱>氯化两面针碱>黄连碱>药根碱,Vmax为：氯化两面针碱>黄连碱>小檗红碱>小檗碱>表小檗碱>药根碱,Clint依次为：氯化两面针碱>黄连碱>小檗碱>药根碱>小檗红碱>表小檗碱。表达OCT1-P341L和OCT2-A270S等位突变基因细胞对小檗碱和黄连碱的亲和力(Km减小)增加至野生型细胞的1.8-11.8倍,内在清除率(Clint)为野生型细胞的1.3-3.8倍。结论：小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗红碱、氯化两面针碱、巴马汀、延胡素甲素、(-)-延胡素乙素均为OCT1/2抑制剂；小檗碱、黄连碱、药根碱、表小檗碱、小檗红碱和氯化两面针碱为OCT1和OCT2底物；OCTl和OCT2基因多态性(OCT1-P341L和OCT2-A270S)使细胞对小檗碱和黄连碱的摄取能力显著高于野生型细胞。第二章有机阳离子转运体在Nitidine肝细胞积聚及毒性中的作用背景和目的：在进行生物碱与OCTl/2相互作用研究时,我们发现氯化两面针碱(nitidine, NC)在OCTs转基因细胞上的毒性明显高于mock细胞,文献也报道了NC在体外肝肾细胞上的毒性。鉴于OCTs在肝、肾组织中的分布,本章主要考察OCTs在NC诱发肝细胞毒性中的作用。除OCT1外,肝组织中也表达OCT3,以及与OCT具有共同底物的多药毒素外排转运体(multidrug and toxin extrusion 1, MATE1),本研究同时考察OCT3及MATE1与NC的相互作用。方法：以稳定表达hOCT3和hMATE1的MDCK细胞(MDCK-hMATE1和MDCK-hOCT3)为模型,考察NC是否为hOCT3或hMATE1的底物,并与OCT1介导的NC细胞摄取能力进行了比较。另以MDCK-hOCT1,MDCK-hOCT3和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,考察hOCT1,hOCT3介导的NC细胞毒性以及(+)/(-)-THP对其细胞毒性的减弱作用,应用大鼠原代肝细胞进行进一步验证。结果：NC在MDCK-hOCT3细胞中的积聚明显高于mock细胞,由hOCT3介导的细胞摄取的动力学参数Km和Vmax分别为2.49±0.45 μmol/L和25.4±1.1pmol/min/mg protein;NC在MDCK-hOCT1/MDCK-hOCT3细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC50值分别为0.163±0.027 μmol/L和0.522±0.072 μmol/L。而在mock细胞上IC50值为17.0 ±4.2 μmol/L。OCT1/3抑制剂(+)/(-)-THP均能显著降低NC的细胞毒性；经0.5μmol/L NC处理,MDCK-hOCT1和MDCK-hOCT3细胞存活率分别降低至空白对照组的17.5±4.7%和55.4±3.8%,50μmol/L的(+)/(-)-THP使MDCK-hOCT1细胞存活率分别升高至对照组的45.6±1.2%和51.6±2%,使MDCK-hOCT3细胞存活率升高至对照组的89.1±5.3%和86.1±7.0%。在大鼠原代肝细胞模型上也观察到(+)/(-)-THP对NC诱发的肝细胞毒性的减弱作用。NC在MDCK-hMATE1细胞上的积聚显著高于mock细胞,其Km、Vmax及Clint分别为0.897±0.085 nmol/L,18.5±1.0 pmol/mg protein/min,为20.6mL/mg protein/min。然而,MATE1对NC的转运能力(Clint:20.6 mL/mg protein/min)明显低于OCT1(Clint：311 mL/mg protein/min)。结论：OCT1,OCT3通过介导NC的细胞摄取,在其致肝细胞毒性中发挥重要作用；(+)/(-)-THP通过抑制OCT1,OCT3介导的细胞摄取而减弱NC的肝细胞毒性。MATE1对NC的转运能力低于OCT1,推测肝细胞中由hOCT1和hOCT3介导的NC摄取大于hMATE1介导的外排。第三章CYP450对Nitidine的代谢解毒作用背景和目的：第二章实验结果显示,NC在大鼠原代肝细胞上的毒性明显低于稳定高表达OCTs的MDCK细胞上的毒性,我们推测原代肝细胞中OCTs表达可能低于稳定转染细胞,推测原代肝细胞中P450酶(CYP450)可能介导NC代谢,从而降低NC的细胞毒性。因此,本章研究CYP酶对NC的代谢及在其肝细胞毒性中的作用。方法：应用人肝微粒体代谢酶表征实验和人重组酶验证,阐明参与NC肝脏代谢的主要CYP酶亚型；比较NC对MDCK-hOCT1细胞及hOCT1与hCYP3A4双转细胞(MDCK-hOCT1/hCYP3A4)的毒性差异,以及CYP3A4抑制剂对NC致MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞毒性的影响,阐明CYP酶对NC的代谢解毒作用。结果：CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的肝脏代谢。NC (0.25-10 μmol/L)对MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞的毒性明显低于对MDCK-hOCT1细胞的毒性；CYP3A4抑制剂,氟康唑和红霉素,显著增强NC在MDCK-hOCT1/hCYP3A4细胞上的毒性,提示CYP3A4通过介导NC代谢而减弱NC的毒性。结论：肝脏CYP3A4, CYP2C8, CYP2D6和CYP2B6共同参与NC的一相代谢；CYPs,如CYP3A4,可通过介导NC的肝脏代谢而降低其肝细胞毒性。第四章Nitidine在大鼠体内的药动学和组织分布研究背景和目的：前述研究考察NC在转基因细胞模型及原代肝细胞模型上的摄取及细胞毒性,本章主要考察单次口服和尾静脉注射后,NC在大鼠体内的药动学过程,并计算其口服生物利用度,以推测口服给予NC后在体内是否会引起毒性。同时考察单次及连续20天静脉注射NC (5mg/kg)后,其在大鼠体内的组织分布,以阐明NC分布的组织特异性及连续给药可能由OCTs介导NC细胞摄取发生的组织蓄积现象,为NC的体内毒性提供药动学依据。方法：建立快速、准确、灵敏的LC-MS/MS法测定生物样本中的NC,并将此方法用于测定大鼠口服10mg/kg或尾静脉注射2 mg/kgNC后的血浆药物浓度,计算其口服生物利用度；比较单次静脉注射5 mg/kg NC与相同剂量连续给药20天后相应组织的分布差异。结果：大鼠口服10 mg/kg NC后,血药浓度低,其绝对生物利用度仅为4.8%。鉴于口服NC的生物利用度低,本章考察了大鼠单次静脉注射5 mg/kg NC后的组织分布,结果显示,给药后0.25 h、0.5 h及2h,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度远远高于其在血浆中的浓度,组织与血浆的浓度比值为9.2-2852；以5mg/kg/day的剂量连续静注20天,末次给药后2h,心脏、肝脏、肾脏及小肠中NC的浓度均高于单次给药后相应组织中的浓度。结论：NC的口服生物利用度低,推测其口服后产生毒性的可能性较小。单次静脉注射NC后,心脏、肝脏、肾脏、肺及小肠中NC的浓度高于其在血浆中的浓度。因此,推测大鼠连续静注NC,可能会产生组织蓄积而引起一定的毒性。第五章Nitidine连续给药后大鼠体内的毒性研究背景和目的：前几章研究显示,由于肝脏细胞中OCT1/3介导NC的细胞摄取,导致NC较强的肝细胞毒性。但NC经口给药后绝对生物利用度低,而静脉注射后组织分布研究表明,NC在不少组织中的浓度显著高于血浆中浓度,且连续给药后,在大鼠肝脏、肾脏及心脏等脏器存在蓄积现象,提示连续给药NC在大鼠体内可能引起脏器毒性或整体毒性。因此,本章考察大鼠连续静脉注射NC后的毒性,为NC的研发提供参考。方法：Sprague-Dawley大鼠连续20天静脉注射5 mg/kg/day NC,观察其一般活动行为、体重、检测血清生化指标,组织病理学检查,综合评价NC在体内的整体毒性。以MDCK-hOCT2和mock细胞为模型,采用MTT法及检测细胞培养液中LDH活性的方法,对hOCT2介导的NC细胞毒性以及OCT2抑制剂,(+)/(-)-THP和西咪替丁,对其细胞毒性的减弱作用进行考察。结果：NC可引起大鼠食欲减退,体重减轻,血清LDH值和BUN值明显升高,分别为给药前的2.1倍和1.4倍,ALP值显著降低至给药前的1/5,且组织病理学检查观察到肾小管产生空泡变性,未发现NC在大鼠体内对其它受检脏器引起毒性。此外,NC在MDCK-hOCT2细胞上的毒性远远大于mock细胞,其IC5o值分别为0.556±0.083 μmol/L及17.0 ±4.2 μmol/L,而OCT2抑制剂(+)/(-)-THP和西咪替丁均能显著抑制NC的细胞摄取,从而降低其细胞毒性。提示hOCT2在介导NC细胞摄取引起NC肾脏蓄积而致毒性增强中的重要作用。结论：大鼠连续静脉注射NC 5 mg/kg/day 20天,可能由肾细胞膜上高表达的OCT2介导NC细胞摄取产生肾脏蓄积而引起肾脏损害,但并不能就此排除可能引起其它脏器的毒性。