肺癌是世界范围内癌症相关死亡的首要病因,而非小细胞肺癌(NSCLC)占已诊断肺癌的大约80%。多数NSCLC患者确诊时已处于疾病的晚期,虽然最近10年,新兴的肿瘤分子靶向治疗,尤其靶向驱动癌基因如EGFR突变和ALK融合的发现,改善了一部分NSCLC患者的预后,然而,由于携带这些常见突变的患者仅占进展期NSCLC整个人群的一小部分。NSCLC患者的5年总存活率仍较低(大约15%)。因此,目前迫切需要深入的研究NSCLC发病的分子机制,识别和发现新的治疗靶点以提高NSCLC患者的预后。端粒是真核生物线性染色体末端的一种特殊DNA-蛋白质结构,在大多数的体细胞中,每经历一次的细胞分裂,端粒侵蚀缩短50-200bp,一旦端粒缩短到临界长度,将诱导生长停滞或衰老。端粒酶是细胞内具有逆转录酶活性的核糖蛋白体,通过在染色体单链末端添加5’-TTAGGG-3’的六聚体重复序列,保持染色体完整性和基因组的稳定性,维持细胞的正常分化和繁殖。端粒酶基因敲除小鼠表现出明显的端粒腐蚀和衰老、增殖相关的细胞异常。端粒酶活性可以通过多种途径激活,其中对hTERT基因的转录调控是最主要的方式。hTERT是端粒酶的催化亚基,hTERT基因激活导致端粒延长和细胞永生。而hTERT被蛋白酶体降解或其活性受到抑制,加速端粒缩短,导致肿瘤细胞衰老和凋亡。对hTERT启动子活性的调节可以实现对hTERT基因的表达调控。多种因子被证实直接或间接调节hTERT启动子活性,包括细胞转录激活因子(c-Myc、Sp1、HIF-1、AP2等)和抑制因子(CtBP、p53、WT1、ETS等)。hTER和hTERT是人类端粒酶的核心部分,尽管hTER广泛表达于大多数细胞中包括那些端粒酶阴性细胞,但hTERT在正常体细胞中表达水平非常低。研究表明90%人类癌症都源于端粒酶的功能失调导致的端粒酶激活。端粒酶异常活化状态是肿瘤细胞的持续增殖,克隆演变和恶性进展的决定性因素,与肿瘤的发生发展密切联系。因此在肿瘤细胞中可能存在着肿瘤特有的hTERT激活的潜在机制。探索hTERT的肿瘤特异性的激活机制有可能为治疗肺癌发现新的治疗措施。由于肿瘤时hTERT的再激活和上调主要在转录水平受调控,因此我们试图发现能够与肿瘤特异hTERT启动子结合的新的蛋白因子及hTERT转录的新的调控机制。链霉亲和素琼脂糖垂钓实验法是一种能够有效检测和发现靶基因的未知的启动子调节因子的方法,与高通量蛋白组学结合后可产生有效的筛选体系用于鉴定与DNA序列结合的新蛋白。本研究中,我们利用上述方法垂钓出非小细胞肺癌细胞中hTERT启动子潜在的调节蛋白,并鉴定出其中一种蛋白为ret finger protein-like 3 (RFPL3)。RFPL3基因位于人类22q12.3染色体,属于RFPL蛋白家族,迄今为止,RFPL3在肿瘤中表达和影响hTERT活性的潜在分子作用机制尚不清楚。本研究拟探讨RFPL3作为启动子调节蛋白对NSCLC中hTERT表达和端粒酶活性的影响,进一步研究RFPL3与转录共活化因子CBP间是否存在相互作用以及两者对hTERT转录、端粒酶活性及肿瘤细胞增殖的协同调控作用。最后,探讨CBP和RFPL3在非小细胞肺癌组织中的表达相关性及临床意义。第一部分非小细胞肺癌中RFPL3作为hTERT启动子结合蛋白调控hTERT表达及活性目的：筛选出非小细胞肺癌细胞中与hTERT启动子特异结合的新的调节蛋白RFPL3,并探讨RFPL3表达水平对hTERT表达和端粒酶活性的影响。方法：采取链霉亲和素琼脂糖珠垂钓方法从非小细胞肺癌细胞和正常肺细胞中分离出与hTERT基因启动子结合的大分子量蛋白复合物。利用SDS-PAGE和银染的方法确定出正常细胞中表达量极低或不表达的潜在蛋白质,再利用蛋白组学分析鉴定出新的肺癌特异性的hTERT启动子调节蛋白RFPL3。通过染色质的免疫共沉淀方法验证了RFPL3与hTERT启动子间的特异性结合。利用细胞转染技术将RFPL3质粒和RFPL3siRNA分别转染正常肺细胞系(HBE)和肺癌细胞系(H1299、A549),Western blot用于检测RFPL3和hTERT的蛋白表达。通过荧光酶报告基因分析法和TRAP端粒酶活性分析法进一步研究RFPL3对hTERT启动子和端粒酶活性的调节作用。结果：1、筛选和鉴定出RFPL3是肿瘤特异性的hTERT启动子结合蛋白。2、与正常肺细胞系WI-38和HBE比较,H1299,A549和H322等NSCLC细胞中RFPL3和hTERT的表达显著上调。3、上调(HBE和A549)或减少(A549和H1299)细胞中RFPL3的表达,hTERT蛋白表达也随之增加或减少。4、增加HBE和A549细胞中RFPL3表达时,hTERT启动子活性和端粒酶活性明显增强,而敲低A549和H1299细胞中RFPL3表达时hTERT启动子活性和端粒酶活性明显减弱。结论：RFPL3是一种新的hTERT启动子调节蛋白,在NSCLC细胞中的表达特征性增加。RFPL3能够促进非小细胞肺癌中hTERT的转录和表达,并增强端粒酶活性。第二部分：RFPL3和CBP协同调控非小细胞肺癌中hTERT表达及肿瘤细胞生长目的：探讨非小细胞肺癌中RFPL3和CBP两者是否存在相互作用,进一步研究RFPL3和CBP对hTERT转录、端粒酶活性及肿瘤细胞增殖的协同调控作用和内在分子生物学机制。方法：通过免疫共沉淀(IP)实验验证RFPL3和CBP之间是否存在相互作用,并检测CBP对RFPL3乙酰化水平的影响。利用免疫荧光分析技术观察肿瘤细胞核中RFPL3和CBP的共定位情况。采用瞬时转染技术构建过表达CBP质粒的H1299细胞,并在CBP高表达情况下通过转染RFPL3siRNA敲低RFPL3表达。建立稳定表达RFPL3的H1299细胞系,并通过转染CBPsiRNA敲低CBP表达。通过链霉亲和素琼脂糖垂钓实验法测定CBP对稳定表达RFPL3的H1299细胞中hTERT启动子与RFPL3结合的影响。利用荧光素酶报告基因分析法测定CBP和RFPL3对hTERT启动子活性的协同调控。通过端粒酶重复序列扩增法(TRAP)测定RFPL3和CBP对端粒酶活性的协同影响。MTT法用于检测RFPL3和CBP对肿瘤细胞增殖活力的协同作用。结果：1、H1299、H460、H322、A549细胞中,由RFPL3抗体垂钓的蛋白复合物中都有CBP的表达,而IgG处理组中无CBP条带显示,提示RFPL3蛋白与CBP存在直接的明确的相互作用。2、双荧光免疫染色法证实RFPL3和CBP同时分布于H1299、H322、H460和A549细胞核内。3、用CBP特异性siRNA转染或用CBP抑制剂处理稳定高表达RFPL3的H1299细胞,结果发现与hTERT启动子结合的RFPL3显著降低。4、当RFPL3和CBP其中任何一者被上调或下调,而另一个因子保持不变时,hTERT蛋白的表达、hTERT启动子活性和端粒酶活性,相应的被激活或抑制,肿瘤细胞的增殖能力也被增强或减弱。5、CBP过表达导致RFPL3的乙酰化水平显著增加,而CBP活性被特异性抑制剂c646抑制,RFPL3乙酰化水平下降。CBP介导了肺癌细胞中RFPL3肿瘤特异性的乙酰化。结论：非小细胞肺癌中CBP通过介导RFPL3肿瘤特异性的乙酰化,与RFPL3两者协同调控hTERT 表达、 hTERT启动子活性、端粒酶活性及肿瘤细胞增殖能力。第三部分RFPL3和CBP在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义目的：探讨RFPL3、CBP和hTERT在NSCLC患者肺癌组织中的表达和相关性,进一步研究CBP和RFPL3联合表达与NSCLC患者临床病理特征间的相互联系,及对非小细胞肺癌患者预后的预测意义。方法：利用Western blot检测NSCLC患者肺癌组织标本中CBP和hTERT蛋白的表达情况。选取含有100个肺腺癌患者的肿瘤组织和癌旁组织的组织芯片,利用IHC评价RFPL3、CBP和hTERT蛋白表达。采用Kaplan-Meier法构建生存曲线,研究RFPL3和CBP表达情况与肺腺癌患者临床病理学特征的相关性。采用多因素Cox比例风险分析用于回顾分析判断肺腺癌患者的预后预测因素。结果：1、Western-blot显示NSCLC患者肺癌组织中RFPL3、 CBP和hTERT三种蛋白表达,多数是同时升高。RFPL3、CBP蛋白表达分别和hTERT表达呈正相关。RFPL3和CBP同时高表达的肺癌组织中hTERT表达明显增多。2、组织芯片的免疫组化结果显示RFPL3和CBP同时高表达的肺腺癌患者中hTERT高表达比例明显增加,与两者同时低表达的患者相比差异具有极显著统计学意义(P=0.001)。3、RFPL3和CBP同时高表达与肺腺癌患者性别(P=0.660)、年龄(P=0.741)、病理T分期(P=0.298)、淋巴结转移(P=0.115)等临床特征之间无相关性。4、Kaplan-Meier analysis生存分析显示RFPL3和CBP同时高表达与肺腺癌患者总生存时间缩短显著相关(P<0.001))。RFPL3、CBP和hTERT同时高表达的肺腺癌患者与RFPL3、CBP和hTERT同时低表达的肺腺癌患者相比,OS明显缩短(P<0.001)。5、单变量分析显示,RFPL3和CBP同时高表达(P=0.001)、病理T3期(P=0.045)和有淋巴结转移(P=0.016)提示肺腺癌患者OS短。多因素分析表明RFPL3和CBP同时高表达(P=0.001)是肺腺癌患者OS短的独立预测因子。结论：NSCLC肺癌组织中RFPL3和CBP蛋白表达与hTERT呈正相关。非小细胞肺癌组织中RFPL3和CBP同时高表达是NSCLC患者OS短的独立不良预测因素。