行有性生殖的生物都有两种不同的性别,发育过程中都涉及到性别决定。因此,性别决定与分化及其分子机制是最基础的生物学问题之一。哺乳类性别决定与分化是由一系列转录因子和信号传导因子连接成网构成的协同作用通路,而硬骨鱼类还不清楚。许多经济动物(养殖鱼类)生长速率有明显的性别差异,如尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)雄鱼比雌鱼生长快50%,单性鱼养殖具有较高的经济价值,因此养殖鱼类性别决定与分化的分子机制及性别控制成为水产动物学研究的热点,可以兼顾基础和应用研究。随着大片段基因组文库的构建和高通量DNA测序技术的发展,罗非鱼基因组序列已经公布,但缺乏Y染色体信息,有必要构建含Y染色体信息的大片段基因组文库。长期以来,养殖鱼类缺乏有效的基因敲除手段严重阻碍了其性别决定和分化分子机制的研究。近几年,人工核酸内切酶介导的基因组编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9的出现使我们能对任意物种的基因组进行定点编辑。因此,本研究将探索在罗非鱼建立这两种基因敲除技术,并用于对dmrt1、foxl2、igf3和nanos等基因敲除,研究它们在性别决定与分化中的作用及分子机制。主要研究结果如下：1.以pCC2FOS为载体构建罗非鱼XY个体Fosmid基因组文库,共挑选115200个单菌落,保存在300块384孔板中,构建4800个行池、7200个列池、300个板池和25个超级池,形成微阵列,并对其进行复制备份。该文库插入片段平均长度为40kb左右,覆盖约罗非鱼基因组的3倍。连续传代实验表明,文库具有良好的稳定性。通过构建超级池—板池—行、列池三级池系统形成微阵列,能快速、准确、有效的筛选目的基因,仅需77个PCR反应(超级池25+板池12+行池16+列池24)就能筛到含有目的基因的克隆,解决了普遍存在的文库筛选难题。通过该文库尝试筛选了20个与性别分化相关基因,均获得2-5个阳性克隆,说明文库具有较好的实用性。罗非鱼XY基因组大片段文库的构建,为性别特异分子标记的筛选、性别决定候选基因的克隆、基因组编辑和遗传育种等研究提供了基础。2. TALEN基因组编辑技术已成功运用于多种模式生物。本研究在非模式生物罗非鱼中建立TALEN靶向基因敲除技术,它能高效的对dmrt1和foxl2进行敲除,且最高敲除率达到81%,亚克隆测序证实靶位点产生多种删除或插入不同数目碱基的突变类型。此外,TALEN诱导的高突变率个体在当代(G0)就能产生明显的表型。通过常规组织学、免疫组化、real-time PCR和激素测定等方法检测了Dmrt1和Foxl2缺失对性腺性别分化及相关基因表达的影响,结果显示：XY个体Dmrt1缺失使精巢不能正常发育,如输精管发育异常,精原细胞退化,甚至没有生殖细胞,类固醇生成细胞增生等。Dmrt1缺失的XY个体无性逆转发生。此外,与对照组精巢相比,Dmrt1缺失使精巢中foxl2、雌激素合成酶Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素(17β-雌二醇)水平升高。相反,XX个体Fox12缺失使卵母细胞退化,Cyp19a1a/cyp19a1a和血清雌激素水平显著降低；更重要的是,部分Fox12缺失的XX个体发生性逆转,并伴随Dmrt1和雄激素合成酶Cyp11b2的表达。该研究证实TALEN能高效应用于养殖鱼类罗非鱼的基因敲除；Dmrt1和Foxl2在性腺中拮抗性的参与罗非鱼性别分化,它们主要通过调控Cyp19ala的表达和雌激素的水平来影响性别分化。3.新兴的CRISPR/Cas9已在多个模式生物中证实能有效进行基因组编辑。本研究采用CRISPR/Cas9成功在非模式生物罗非鱼进行nanos2、nanos3、dmrt1和foxl2的敲除,最高突变率达到95%。CRISPR/Cas9诱导的基因突变在当代(G0)也能产生明显的表型。通过GFP-vasa’3UTR标记和生殖细胞特异表达Vasa染色证实,XY性腺缺失Nanos2和XX个体性腺腺缺失Nanos3均导致生殖细胞缺失,且性腺成中空管状结构。免疫组化结果显示Nanos2缺失的XY精巢仍然表达Dmrt1和Cyp11b2;而Nanos3缺失的XX性腺体细胞雄性化,表达Dmrt1和Cyp11b2,司时伴随着敲除鱼血清雄激素(11-KT)的上调和雌激素的下调。该结果表明无论基因型如何,生殖细胞缺失均导致性腺体细胞的雄性化。此外,CRISPR/Cas9敲除Dmrtl和Foxl2所产生的表型与TALEN敲除结果一致。CRISPR/Cas9诱导的foxl2和dmrt1突变能通过生殖细胞高效传递到F1代。F1代中检测到移码和非移码的foxl2突变体,这与其XX亲本的突变类型相一致；然而,与dmrt1XY亲本突变类型不一致,敲除鱼的精子以及受精获得的F1代中仅检测到非移码的突变,这说明Dmrt1对罗非鱼精子发育和成熟具有重要作用。这些结果表明CRISPR/Cas9可用于罗非鱼基因的高效、快速编辑,而且是可遗传的。4.最近,本实验室发现一个仅在硬骨鱼类存在的igf3,它只在性腺表达,然而,它在性腺发育过程中的表达模式、转录调控及在性腺分化中的作用还有待阐明。我们通过real-timePCR检测发现igf3在孵化后5天到孵化后40天卵巢的表达量高于精巢,而孵化后50天到孵化后70天低于精巢的表达。通过制备Igf3多克隆抗体,免疫组化检测显示Igf3在孵化后10天到成体雌雄性腺的体细胞中表达。利用Igf3重组蛋白处理原代培养的卵巢和精巢细胞,real-time PCR检测发现Igf3以时问、剂量依赖的方式增强性腺分化相关转录因子foxl2、 dmrt1、 nr5a1(sfl)和类固醇酶cyp19a1a、cyp11b2、cyp11a1、hsd3b2和cyp17a1的表达。通过CRISPR/Cas9成功在XX、XY罗非鱼敲除igf3基因,单条鱼的突变率最高达到95%。Igf3缺失导致3月龄XY性腺中无精母细胞和精细胞、但存在精原细胞,精巢只有少量Cyp11b2表达；而对照组XY精巢存在各级生精细胞,且有大量Cyp11b2表达。Real-time PCR结果显示：敲除鱼性腺dmrt1、nr5a1和cyp11b2mRNA的表达水平也明显低于对照鱼。与此相吻合,激素测定进一步证实敲除鱼血清雄激素水平明显低于对照鱼。另一方面,Igf3缺失导致3月龄XX卵巢中存在大量卵原细胞,极少的Ⅰ、Ⅱ时相卵母细胞,卵巢只有少量Cypl9ala表达；而对照组XX卵巢已有大量各时相卵母细胞,只有边缘存在少量卵原细胞,卵巢中大量的Cyp19a1a表达于间质细胞。Real-time PCR结果也显示：敲除鱼foxl2、nr5a1和cyp19a1a mRNA的表达水平也明显低于对照鱼。与此相吻合,激素测定进一步证实敲除鱼血清雌激素水平明显低于对照鱼。这些体外和体内研究都表明Igf3参与调控性别分化相关转录因子和类固醇酶的表达,且Igf3参与调控罗非鱼生殖细胞的减数分裂。最后,利用Fosmid文库获得的igf3启动子序列,构建双荧光素酶报告基因载体在HEK293细胞中进行启动子分析发现：igf3能直接被Nr5a1(Sfl)激活,而Fox12、NrOb1a (Dax1)和NrOblb (Dax2)单独转染没有作用,但与Nr5al共转染时均能增强Nr5al激活的igf3转录活性；然而,Dmrt1、雌激素在与受体共转染时抑制igf3的转录。Forskolin能增强Nr5al和igf3的转录。此外,igf3在Dmrt1和Foxl2TALEN敲除鱼的表达升高。这些结果表明Igf3能调控foxl2、dmrtl、nr5a1和类固醇合成酶的表达,反之,igf3的表达又受到Foxl2、Dmrt1、Nr5a1和雌激素的调控,它们之间形成紧密的调控环作用于罗非鱼生殖细胞的减数分裂。综上所述：本研究建立了罗非鱼微阵列Fosmid基因组文库、TALEN和CRISPR/Cas9靶向基因敲除技术,通过TALEN和CRISPR/Cas9研究了Dmrt1、Foxl2、Nanos2、Nanos3以及新发现的Igf3在硬骨鱼类性别决定与分化的功能,证明其在研究硬骨鱼类性别决定与分化的分子机制方面具有独特的优势。目前这些技术已广泛用于本实验室罗非鱼基因筛选和基因编辑。TALEN和CRISPR/Cas9技术的建立为养殖鱼类的基因功能以及性别控制研究提供有效的技术手段。