CYP450是人体内最重要的药物代谢酶,已经被证明为体内代谢外源性化学物质的关键酶,包括对环境致癌物和致毒物的代谢活化。人CYP亚型酶的基因内存在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP), SNP可通过改变基因表达或蛋白中氨基酸组成来影响酶的合成和活性,从而改变药物代谢酶的代谢活化能力,决定个体对致癌物易感性的差异。黄曲霉毒素B1 (AFB1)为Aspergillus flavus和Aspergillus parasiticus霉菌株所产生的毒素,AFB1除具有强烈的急性毒性以外,已被世界卫生组织(WHO)和美国国立卫生研究院(NIH)确认为人的致癌物。香豆素是一种在自然广泛分布的物质,目前大量应用在香水、卫生用品、烟草产品和一些疾病的治疗中。已经有文献报道,香豆素和AFB1同时被代谢时,香豆素能增强AFB1的毒性。同其它环境致癌物一样,AFB1和香豆素的致毒致癌作用首先需要通过代谢活化才能产生。CYP2A13在人的呼吸道组织中表达最高,并且能高效的代谢AFB1和香豆素,因此被认为是人肺组织中代谢活化AFB1和香豆素的关键酶。由于香豆素和AFB1同时被代谢时,香豆素能增强AFB1的毒性,所以CYP2A13多态性能否改变其代谢香豆素能力,对AFB1致癌易感性的个体差异研究有重要指导意义。重组药物代谢酶是药物体外代谢研究的一项重要工具,可以为体内代谢得到的结果提供一些解释和依据或者用来预测体内代谢的情况。通过体外重组表达某个酶的多种突变体,并对它们催化代谢某种环境毒物的能力进行评价比较,所得结果可以为分子流行病学研究提供一些参考信息。本实验采用Bac-to-Bac(?)杆状病毒昆虫细胞表达系统获得了活性较好的CYP2A13的野生型及其突变型蛋白,并用以研究野生型CYP2A13蛋白及其突变型CYP2A13蛋白在香豆素代谢上的差异。此外,我们还考察了中国汉族人群中CYP2A13的基因多态性分布,并进行了CYP2A13基因多态性与肺癌易感性的关联分析。一.野生型CYP2A13及其突变株的构建及表达目前可应用多种表达系统表达代谢酶,其中主要包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞系统和杆状病毒昆虫细胞表达系统。本实验采用Bac-to-Bac(?)杆状病毒昆虫细胞表达系统来获得重组CYP2A13野生型和各突变型蛋白。本实验从肺组织中,通过RT-PCR获得野生型CYP2A13的基因,并通过PCR在CYP2A13基因终止密码子前加入6个组氨酸密码子,以便用his-tag抗体进行western blot鉴定。然后,以此CYP2A13野生型基因序列为基础,用PCR在基因的两侧加入Xba I和Xho I的酶切位点,并通过定点突变技术获得突变体的DNA序列。经测序验证后,选取序列正确的CYP2A13与pFastBacTM 1质粒连接,构建pFastBacTM1-2A13s重组质粒。重组pFastBacTM1-CYP2A13s转化MAX Efficiency DH10BacTM competent Escherichia coli后,在DH10Bac中发生转座,获得Bacmid-CYP2A13s重组粘粒。用此重组粘粒转染Sf9细胞,即可获得第一代重组杆状病毒。优化好重组杆状病毒的滴度与感染细胞的MOI值后,便可用重组杆状病毒感染Sf9细胞,72 h后收集细胞,经洗涤超声破碎后,采用western blot进行蛋白表达鉴定,并用CO差示光谱法测定CYP2A13浓度。结果显示获得了活性较好的重组CYP2A13野生型和各突变型蛋白。二. CYP2A13野生型及其突变型蛋白对香豆素的代谢研究CYP2A13是一种主要在人的呼吸道组织中表达的药物代谢酶。2005年,首次发现经异源表达系统(baculovirus/Sf9 cells)而产生的人CYP2A13蛋白可有效代谢AFB1成多种代谢产物,其中包括致癌性代谢物AFB1-8,9-epoxide和AFM1-8,9-epoxide。与公认代谢AFB1最具活力的CYP1A2相比,CYP2A13产生的AFB1-8,9-epoxide约为CYP1A2的1/3而产生的AFM1-8,9-epoxide的水平则相当于CYP1A2。通过CHO细胞毒性实验,证明CYP2A13导致的AFB1细胞毒性反应远超过CYP1A2和CYP3A4.已有文献报道,香豆素和AFB1同时被代谢时,香豆素能增强AFB1的毒性。由于CYP2A13的基因多态性对其代谢激活AFB1而导致的细胞毒性影响不大,所以CYP2A13多态性能否改变其代谢香豆素的能力,对今后以分子流行病学手段研究对AFB1致癌易感性的个体差异进而保护易感人群有重要指导意义。在本实验中,通过Bac-to-Bac(?)表达系统获得CYP2A13野生型和突变型蛋白,制备成微粒体,体外代谢香豆素,用HPLC和荧光检测器分离检测香豆素代谢物——7-羟基香豆素。从代谢数据来看,我们发现CYP2A13野生型及其突变株蛋白代谢香豆素在Km值上没有显著差异。在CLint (Vmax/km)上,CYP2A13*2、CYP2A13*5CYP2A13*6、CYP2A13*9与野生型相比有40%到108%的增加量；CYP2A13*8与野生型相比,没有任何差异。而CYP2A13*4则检测不到任何香豆素代谢活性。我们采用sybyl软件对野生型CYP2A13进行突变,构建各突变体模型,选用Amber软件进行分子动力学模拟,取平衡后的平均构象,比较各突变体与野生型CYP2A13的结构变化。并采用Autodock软件将香豆素分子对接到野生型CYP2A13和各突变体中血红素上方的底物结合口袋,将对接得到的模型用Amber软件进行分子动力学模拟,计算各蛋白与香豆素的反应能量。从得到的模型和数据来看,说明了CYP2A13野生型和突变型蛋白代谢香豆素的动力学差异是源于各种SNP突变造成的蛋白构象差异。本文首次用sf9表达全部CYP2A13的错义突变体来比较它们在香豆素代谢上的差异,并用分子动力学模拟来阐释了产生差异的相关机理。本文也是首次阐释了CYP2A13*4失活的机理。三.CYP2A13基因多态性在中国汉族人群中的分布及CYP2A13基因多态性与肺癌易感性的关联分析CYP2A13基因与其它细胞色素P450酶基因相似,具有基因多态性,CYP2A13的遗传变异可能导致不同的表型,引起人群对环境毒物的敏感性的差异。CYP2A13基因的遗传多态性已经被广泛报道,其中可引起CYP2A13蛋白中氨基酸发生错义改变(missense)的变异体为8种,其中CYP2A13*2、CYP2A13*5, CYP2A13*6、CYP2A13*8和CYP2A13*9具有代谢活性,而CYP2A13*3、CYP2A13*4和CYP2A13*7被证明是无效等位基因。本文将集中研究CYP2A13基因多态性在中国人群中的分布和与肺癌易感性之间的相关性。我们使用ASA方法在140个基因组DNA中检测了CYP2A13基因的等位基因在中国汉族人群中的分布。5个阳性对照的实验结果和测序结果完全一致。CYP2A13*2、CYP2A13*3、CYP2A13*4、CYP2A13*5、CYP2A13*6、CYP2A13*7、CYP2A13*8和CYP2A13*9在中国汉族人群中的分布频率分别是6.8%、1.1%、4.0%、1.1%、1.5%、4.0%、1.1%和0.4%。与其它已报道过CYP2A13多态性分布的种族相比,CYP2A13*3在日本人中有较高的分布频率(4.9%),而CYP2A13*4在日本人群中分布较低(0.3%)。CYP2A13*7.CYP2A13*8和CYP2A13*9在高斯人群和中国汉族人群中基本没有差异。本文首次确认了所有CYP2A13可编码区SNPs在中国汉族人群中的分布,结果提示中国汉族人群和日本人群之间可能存在NNK和AFB1毒性易感性的差异。CYP2A13*2、CYP2A13*5、CYP2A13*6、CYP2A13*8和CYP2A13*9虽然体外代谢实验中表现出了一定的活性差异,但是有研究表明这五个突变体在AFB1和NNK导致的细胞毒性上差异不大,因此我们认为这五个突变体对肺癌易感性的影响不大。为了证明此推测,我们检测了肺癌人群中CYP2A13等位基因的分布,并将得到的数据和正常人群进行比较,进行关联分析。结果发现两组人群中CYP2A13基因的这5个等位基因的分布没有显著差异,CYP2A13*2、CYP2A13*5、CYP2A13*6、CYP2A13*8和CYP2A13*9与肺癌易感性没有相关性。同时,我们也发现CYP2A13*3、CYP2A13*4和CYP2A13*7这3个失活等位基因在两组人群中的分布也没有显著差异。综合文献和人群分布数据,我们认为可能有如下三个原因：1)CYP2A13*3、CYP2A13*4和CYP2A13*7这三个等位基因多以杂合子的形式存在于中国汉族人群,减弱了CYP2A13*3、CYP2A13*4和CYP2A13*7的保护作用；2)一些与CYP酶系活性相关的蛋白,其基因多态性能对CYP2A13活性产生极大的影响,比如POR,其突变体能使得野生型CYP2A13的活性增加10倍,这些因素的存在,也极大的减弱了CYP2A13*3、CYP2A13*4和CYP2A13*7的保护作用；3)CYP2A13的确可以通过代谢激活NNK、AFB1等环境毒物而导致肿瘤发生,但是除了CYP2A13外,人肺组织中可能还存在其它能有效地代谢激活NNK、AFB1等环境毒物的代谢酶,而这些酶的基因多态性决定了个体易感性的差异。本课题得到的实验结果提示,由于CYP2A13的基因多态性对个体NNK、AFB1等环境毒物的敏感性影响不大,可能还存在其它机制导致了个体对NNK、AFB1等环境毒物的易感性的差异,从而产生了个体肺癌易感性上的不同。这意味着在我们设计和解释NNK、AFB1相关的肺癌流行病学研究时,应该要考虑到CYP2A13之外的更多因素。