残留白血病(MRD)检测对于评估疾病状态、判断疗效、指导治疗及预测复发均具有重要意义。虽然生存期观察、形态学检测、细胞遗传学检测、流式细胞仪(FCM)检测免疫表型、移植生物实验、转基因、实时荧光定量PCR(RQ-PCR)检测白血病特异融合基因等方法均可用于MRD检测[1-4],但能用于肿瘤负荷相对较低的白血病缓解期MRD检测方法较少,RQ-PCR方法因敏感性高成为目前国内外应用的主要方法,前提条件是有合适的白血病特异性靶基因。但目前已知的白血病特异性融合基因数量少,寻找白血病相对特异的靶基因成为关键难题。基因芯片技术能够对大量基因进行快速平行化分析,同时与实时荧光定量PCR结合运用,对差异表达基因进行检测鉴定,可用于筛选用于检测MRD的白血病标志基因。本实验探讨基因芯片技术结合实时荧光定量PCR寻找小鼠粒单细胞白血病的标志基因的可行性。目的本实验利用WEHI-3粒单白血病细胞在正常CB6F1雌性小鼠体内建立粒单细胞白血病动物模型,应用基因芯片技术筛选出小鼠粒单细胞白血病差异表达基因,利用实时荧光定量PCR技术分别对正常小鼠骨髓及白血病小鼠骨髓的差异表达基因进行检测鉴定,获得小鼠粒单细胞白血病的标志基因。方法1.建立白血病模型:将体外培养的处在指数生长期的WEHI-3细胞通过尾静脉接种于CB6F1小鼠体内,再通过外周血计数及涂片分类、骨髓甩片检测形态学及细胞化学检测、免疫分型检测、细胞遗传学、病理检测等方法鉴定小鼠粒单细胞白血病模型的建立。2.用基因芯片技术初步筛选白血病相关基因:培养WEHI-3白血病细胞,分别取WEHI-3白血病细胞及正常小鼠骨髓组织,提取总RNA并逆转录成cDNA及进行纯度鉴定,随后进行荧光探针标记,与32K小鼠全基因组芯片杂交洗涤后扫描,最后进行图像采集及数据分析。筛选出白血病小鼠骨髓组织的差异表达基因,选取上调基因中表达较高的肿瘤相关基因作为标志基因的候选基因。3.随机选取10只正常小鼠及10只粒单细胞白血病小鼠处死后分别提取骨髓中单个核细胞总RNA,逆转录成cDNA备用。4.采用实时荧光定量PCR进一步验证、确认白血病相关基因:针对基因芯片技术筛选出的差异基因,根据NCBI上基因序列设计引物及探针,配制所选基因及小鼠管家基因β-actin的PCR反应体系。采用实时荧光定量PCR仪对正常小鼠及粒单细胞白血病小鼠骨髓cDNA进行PCR扩增。通过与标准曲线比对计算出基因拷贝数,然后根据与管家基因拷贝数的比值推算出各基因表达率。分析上述基因在白血病鼠与正常鼠骨髓组织中表达率的差异。结果1. CB6F1小鼠尾静脉接种WEHI-3白血病细胞后100%发病,经外周血计数及涂片分类、骨髓甩片、流式细胞学、细胞遗传学、病理检测等鉴定后成功建立了全身播散的粒单细胞白血病模型。2.基因芯片技术筛选出白血病细胞差异基因共3465个,Ratio=白血病组织/正常鼠组织。差异基因筛选标准:Score≥2,同时差异倍数为2倍以上,样本数≥3。样品各项检测参数均达到质量控制要求:(1)外标、内标、Hex等阳性对照信号正常,阴性对照检测均为阴性;(2)看家基因重复性好,差异比值CV不超过0.3;未见影响数据的污染,漏点率未超过3‰;(3)检测率正常。最后筛选出NOV、BNIP3、GPR160、DAB2、FAM110C等5种肿瘤相关的表达差异较大的候选基因。3.设计并合成差异基因及管家基因引物和探针,基因测序验证正确,并成功建立质粒标准品,利用实时荧光定量PCR技术对白血病鼠及正常小鼠cDNA差异基因进行扩增,分析上述基因在白血病小鼠与正常小鼠骨髓中表达率的差异。NOV、BNIP3、DAB2基因表达率在正常组及白血病组中表达有显著差异,P值<0.01,以NOV基因差异性最为显著,P值=0.000,GPR160及FAM110C基因表达率的差异均无统计学意义,P值>0.05。结论1.我们于正常CB6F1小鼠尾静脉接种WEHI-3白血病细胞,成功建立了全身播散的粒单细胞白血病模型,是进行新药疗效试验、生物导向治疗及基因治疗的理想工具。2.本实验采用基因芯片技术筛选出白血病鼠的NOV、BNIP3、GPR160、DAB2、FAM110C等5种差异基因,均为肿瘤相关基因,可作为候选基因进一步筛选标志基因。3.经实时荧光定量PCR进行验证,提示NOV、BNIP3、DAB2基因表达率在正常组及白血病组中表达有显著差异,成功获得了小鼠粒单细胞白血病的标志基因。为小鼠粒单细胞白血病模型的进一步实验提供了重要检测工具。