背景：冠心病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病,不同程度地影响患者的生活质量。“双参通冠方”是本室研制的组分配伍复方中药,在组方筛选、药效、药理、药代动力学等方面进行了大量的研究工作。但在成药性方面还需深入研究,尤其是要明确是否存在潜在的药物相互作用,以保证用药安全。目的：1、为了获得足够量的目标化合物,从延胡索中分离纯化延胡索生物碱,从人参茎叶总皂苷中分离纯化人参皂苷。2、根据FDA药物相互作用研究指南(草案)的原则,选择CYP1A2.CYP2C9.CYP2C19, CYP2D6和CYP3A4等5种CYP同工酶,研究“双参通冠方”入血成分人参皂苷和延胡索生物碱对人肝药物代谢酶的抑制作用。3、研究延胡索甲素的肝微粒体生物转化。4、研究“双参通冠方”入血成分人参皂苷和延胡索生物碱对一氧化氮生成的抑制作用。方法：1、采用溶剂法和色谱法分离纯化延胡索生物碱和人参皂苷,根据物化常数和各种谱学数据鉴定化合物结构。2、将人肝微粒体与受试物(延胡索生物碱和人参皂苷)或阳性抑制剂与CYP探针底物孵育,用高效液相色谱-质谱联用法测定孵育液中特异性探针底物代谢产物的生成率,得到各同工酶的相对活性并计算相应的CYP同工酶的IC5。值,评价受试物对CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4的潜在抑制作用。3、采用NADPH再生系统,温孵液总体积为1000mL,内含大鼠肝微粒体100mL(以蛋白质计浓度为21.39mg/mL),100niM PBS (pH7.4),300mg延胡索甲素。在37℃水浴预温孵5min后,加入NADPH再生系统(1.0mM NADP,0.5mM NADH,10mM葡萄糖-6-磷酸盐,1000IU/mL葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶和4.0mM MgC12)启动反应,在37℃振荡器培养水浴中温孵2h,然后加入1000mL冰冷的EtOAc终止反应,取有机层：残留水层再用EtOAc萃取7次,合并萃取液,减压浓缩,N2吹仪吹干,得残渣2.8g。将其进行硅胶柱色谱和HPLC制备分离、纯化,得转化产物,根据NMR和MS数据鉴定转化产物结构。对于转化分析,采用本实验室优化的大鼠肝微粒体温孵体系。温孵液总体积为500μL,包括5μL大鼠肝微粒体(以蛋白质计浓度为21.39mg/mL)或人肝微粒体(0.2mg/mL),100mM PBS (pH7.4),0.1μM延胡索甲素。在37℃水浴预温孵5min后,加入NADPH再生系统启动反应,在37℃振荡器培养水浴中温孵5、10、30min,然后加入100μL冰冷的终止液(甲醇-乙腈=1：4,含内标咖啡因)终止反应,在16000×g离心10min,取上清在温和的氮气流下吹干,残渣重悬于100μL的10%乙腈水溶液,过0.45μm微孔滤膜,取10μL续滤液进样LC-MS系统分析。4、采用国际公认的脂多糖活化的BALB/c裸小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(NO)模型,研究人参皂苷和延胡索生物碱对NO产生的抑制作用。由于NO的半衰期非常短,通过直接测定亚硝酸盐的聚集量代表NO的产生量。结果：1、从延胡索分离得到20个生物碱,根据物化常数和谱学数据分别鉴定为四氢黄连碱(1)、四氢非洲防己碱(2)、延胡索乙素(3)、紫堇球碱(4)、异紫堇球碱(5)、8-三氯甲基-7,8-二氢黄连碱(6)、延胡索甲素(7)、8-酮基黄连碱(8)、左旋紫堇根碱(9)、去氢延胡索甲素(10)、13-甲基巴马亭红碱(11)、氧化海罂粟碱(12)、原阿片碱(13)、降氧化北美黄连次碱(14)、四氢小檗碱(15)、二去氢海罂粟碱(16)、黄海罂粟灵碱(17)、黄连碱(18)、巴马亭(19)、小檗碱(20)。从人参茎叶总皂苷分离得到8个皂苷,根据物化常数和谱学数据分别鉴定为20S-人参皂苷Rg1(20S-ginsenoside Rg,,21)、人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb,,22)、人参皂苷Re(ginsenoside Re,23)、20S-人参皂苷Rh1(20S-ginsenoside Rh1,24)、20R-人参皂苷Rh1(20R-ginsenoside Rh1,25)、205-人参皂苷Rg2(20S-ginsenoside Rg2,26)、20R-人参皂苷Rg2(20R-ginsenoside Rg2,27)和人参皂苷Rd (ginsenoside Rd,28).2、在离体试验中,人参皂苷Rb1、Rd、Re和Rg1对人肝药物代谢酶亚型CYP1A2、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性无抑制作用,IC50值大于200μM。延胡索生物碱中,延胡索甲素对CYP2C9和CYP2C19具有选择性抑制作用；延胡索乙素对CYP2D6具有选择性抑制作用；二去氢海罂粟碱对6个亚型抑制作用的IC50值皆小于1μ M。3、延胡索甲素在苯巴比妥诱导的大鼠肝微粒体离体温孵体系中,可转化为9-0-去甲基延胡索甲素、9,10-二-0-去甲基延胡索甲素、元胡宁、4-羟基延胡索甲素、5-羟基延胡索甲素、紫堇球碱和异紫堇球碱等。主要的转化产物为9-0-去甲基延胡索甲素。4、人参皂苷Rb1、 Rd、Re、Rf、Rg、 Re。和吉林人参皂苷醇对脂多糖活化的RAW264.7细胞释放N0具有抑制作用,IC50值分别为69.67±3.28、62.41±3.02、85.59±2.43、74.14±2.65、80.89±2.00、79.83±1.78、70.96±2.05μM,呈浓度依赖效应。阳性对照药吲哚美辛的IC50值为63.75±3.33μM。人参皂苷Rb1、 Rd和吉林人参皂苷醇的作用强度与吲哚美辛的几乎相同,特别是人参皂苷Rd的作用强度与吲哚美辛的相同。选择延胡索中代表性生物碱延胡索乙素、8-酮基黄连碱、去氢延胡索甲素和氧化海罂粟碱进行脂多糖活化的RAW264.7细胞释放N0抑制试验,IC50值分别为218.02±1.50、161.37±7.88、133.29±4.81和46.04±1.99μM。结果表明原小檗碱型生物碱抑制活性属中等,而阿朴啡型生物碱氧化海罂粟碱的抑制活性强于阳性对照药吲哚美辛。结论：1、延胡索中的生物碱,主要为原小檗碱和阿朴啡两个类型,后者为吗啡衍生物。应用2D NMR技术,本研究首次全归属了8-三氯甲基-7,8-二氢黄连碱和二去氢海罂粟碱的碳、氢NMR信号。8-三氟甲基-7,8-二氢黄连碱、左旋紫堇根碱和二去氢海罂粟碱均为首次从延胡索中分离得到。2、“双参通冠方”入血人参皂苷类成分人参皂苷Rb1、 Rd、Re和Rg1对人肝药物代谢酶亚型CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4活性无抑制作用,提示可能不会发生临床意义上的药物相互作用。“双参通冠方”入血生物碱类成分,延胡索甲素选择性抑制CYP2C9和CYP2C19酶活性,IC50值分别为36.81和25.54μM；延胡索乙素选择性抑制CYP2D6酶活性,IC5。值为11.26μM。二去氢海罂粟碱对6个CYP亚型皆有抑制活性,IC50值皆小于1μ M。提示可能会发生临床意义上的药物相互作用,应予以警惕。3、延胡索甲素在大鼠离体肝微粒体中的主要转化产物为9-0-去甲基延胡索甲素；主要生物转化途径为脱甲基和羟基化反应。4、从“双参通冠方”入血人参皂苷类成分人参皂苷Rb1、Rd、Re和Rg1对N0产生具有抑制作用,提示“双参通冠方”也许发挥有益的抗炎作用和治疗心血管疾病。