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目的:设计和构建第三代靶向前列腺特异性膜抗原(PSMA)的人源化嵌合抗原受体(CAR)基因,制备慢病毒原液感染Jurkat和Molt-4细胞以建立人源化PSMA-CAR T细胞体系及初步鉴定其CAR基因表达和细胞杀伤功能。方法:(1)参考Carl H.June等学者的CD19特异性CAR结构设计,查阅NCBI、PDB及IMGT数据库,设计构建第三代靶向人前列腺癌PSMA抗原的人源化嵌合抗原受体。CAR受体的胞外识别结构域为人源化PSMA单克隆抗体的单链可变区(svFv),跨膜结构域为CD8α的铰链区和跨膜区,胞内信号结构域为TCR受体的CD3ζ链及CD28、4-1BB双共刺激分子信号域,整理并合成全长碱基序列,构建重组CAR基因的慢病毒载体及进行初步鉴定;(2)利用磷酸钙法包装与制备慢病毒,离心法感染Jurkat和Molt-4细胞进行CAR基因修饰,通过流式细胞术检测感染效率,并找出合适的慢病毒感染方法,建立人源化PSMA-CAR T细胞体系;(3)利用real-time PCR和protein-L间接标记法检测CAR基因在T细胞体系的RNA水平及细胞表面表达情况;(4)通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法初步检测人源化PSMA-CAR T细胞的杀伤活性。结果:(1)成功合成CAR基因全长碱基序列,重组CAR基因的慢病毒载体通过凝胶电泳法鉴定;(2)磷酸钙法包装制备的慢病毒原液对Jurkat和Molt-4细胞具有较高的感染效率,单次感染效率可达30%左右,24h后重复感染效率可达50%以上;(3)经特定CAR基因修饰前后的Jurkat和Molt-4细胞的CAR基因RNA水平及细胞表面表达情况有明显差异;(4)LDH释放法显示特定CAR基因修饰Molt-4细胞对靶细胞具有一定程度地杀伤活性,而特定CAR基因修饰的Jurkat细胞对靶细胞无法产生杀伤活性。结论:1.慢病毒对Jurka和Molt-4细胞具有较高的感染效率,磷酸钙法制备的慢病毒原液能够用于T细胞株的基因转导;2.本课题中设计构建的人源化PSMA-CAR基因能够在T细胞内及表面成功表达;3.人源化PSMA-CAR基因修饰的Molt-4细胞与Jurkat细胞相比,对靶细胞显示出杀伤效应,初步鉴定了人源化PSMA-CAR基因的成功构建,Molt-4细胞能够模拟原代T淋巴细胞的部分杀伤效应功能,可作为工具T细胞用于CAR T细胞技术的部分基础研究。