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目的本研究旨在探究lncRNA XXYLT1-AS2(XXYLT1-AS2)在动脉粥样硬化内皮功能障碍中作用和机制,探索其作为动脉粥样硬化临床靶向治疗靶点的潜在可能性。方法(1)使用生物信息学方法分析GEO数据库,获取差异性表达的基因,构建颈动脉球囊损伤大鼠模型,通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、实时荧光定量PCR分析(RealTime Quantitative PCR,RT-qPCR)鉴定目的基因XXYLT1-AS2的物种保守性,检测在细胞系和大鼠球囊损伤模型颈动脉中的表达;(2)构建XXYLT1-AS2过表达物及抑制物,使用CCK8、EdU和细胞划痕的实验方法细胞水平检测lncRNA对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)增殖和迁移的影响;(3)通过Western blot、单核细胞黏附实验和RT-qPCR等方法检测在肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)炎性刺激下XXYLT1-AS2对内皮细胞黏附和相关黏附、炎症因子分泌的影响;(4)荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)定位lncRNA在细胞的位置,并根据核定位通过生物信息软件预测XXYLT1-AS2下游靶标蛋白;RNA免疫沉淀实验(RNA Immunoprecipitation,RIP)、RNA pulldown、免疫荧光实验(Immunofluorescence,IF)和FISH共定位分析lncRNA与靶蛋白FUS的相互作用及靶向性;(5)合成沉默靶蛋白FUS抑制物,通过CCK8、EdU、细胞划痕实验、Western blot、单核细胞黏附实验和RT-qPCR检测FUS对HUVEC增殖、迁移和黏附炎症的生物学功能的影响;(6)氧化低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,ox-LDL)病理条件下共转染lncRNA和靶蛋白,Western blot、CCK8、EdU、细胞划痕实验等检测lncRNA是否靶向下游蛋白FUS调控细胞周期蛋白D1(cycling D1,CCND1),从而对HUVEC生物学功能产生影响;(7)分别收集健康个体正常动脉和动脉粥样硬化患者病变动脉,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和FISH实验分别检测lncRNA和FUS在各组表达情况。结果(1)生物信息学分析和RT-qPCR筛选出有差异表达的目的研究基因XXYLT1-AS2,其具有高度大鼠保守性和人脐静脉内皮细胞中高丰度表达,且在大鼠颈动脉球囊损伤模型中表达明显下降(P<0.05);(2)RT-qPCR验证lncRNA抑制物和过表达物转染效果良好(P<0.05);CCK8、EdU和细胞划痕实验结果显示相对于NC组,转染XXYLT1-AS2的细胞具有抑制增殖和迁移的能力(P<0.05);(3)用单核细胞黏附实验和RT-qPCR检测对细胞黏附和分泌黏附、炎症因子的影响,结果表明与NC相比,lncRNA过表达组显著抑制细胞黏附及黏附炎症因子的表达(P<0.05);(4)原位杂交实验表明lncRNA定位为细胞核;catRAPID软件预测结果表明,FUS极可能是lncRNA的下游靶点;RIP、RNA pulldown、免疫荧光和原位杂交共定位分析证明lncRNA与靶蛋白FUS的相互作用及靶向性;(5)敲低lncRNA的表达,HUVEC增殖、迁移能力增加,黏附及分泌黏附炎症因子的能力增强;(6)经ox-LDL刺激人脐静脉内皮细胞,CCK8、EdU和划痕检测结果均显示与lncRNA过表达组相比XXYLT1-AS2+si-FUS组细胞增殖和迁移效率明显增加(P<0.05);(7)与健康组相比,动脉粥样硬化患者组的主动脉中XXYLT1-AS2和FUS表达量均下降(P<0.05)。结论我们首次发现未报道的lncRNA XXYLT1-AS2在动脉粥样硬化的发生发展过程中具有保护性作用。lncRNA XXYLT1-AS2通过蛋白FUS调控CCND1表达,从而抑制HUVEC增殖和迁移;同时XXYLT1-AS2和FUS还通过抑制AKT和NF-κB信号的传导,减轻单核细胞黏附和炎症。这可能为动脉粥样硬化提供一种潜在的治疗策略。