论文部分内容阅读
中国水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是我国传统十大名花之一，是重要的观赏花卉。但中国水仙花色过于单一，目前只有黄白色。为探讨中国水仙不能合成花青素的原因，本研究以中国水仙‘金盏银台’为材料，通过染色体步移法克隆类黄酮代谢途径中花青素和黄酮醇分支关键基因NtDFR和NtFLS的启动子。采用生物信息分析，载体构建、烟草的瞬时表达、GUS组织染色法和定量PCR研究启动子的活性以及中国水仙R2R3-MYB转录因子对这两个结构基因的调控作用，为了解中国水仙花色形成机理提供理论基础。此外，构建同时抑制类胡萝卜素代谢途径中关键基因LYCE和LYCB的RNAi表达干扰载体，为进一步转化中国水仙、创新中国水仙花色奠定基础。
主要研究内容及得到的结果如下:
1. 本研究采用染色体步移法从中国水仙中分别克隆了NtDFR和NtFLS基因起始密码子上游962 bp和968 bp的启动子序列。Genbank登录号为JX310698和MH472580。生物信息学分析结果表明，NtDFR和NtFLS启动子序列除包含TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件外，还包含光调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件等多个顺式作用元件。此外，NtDFR和NtFLS启动子序列还含有MYB转录因子结合位点。
2. 为验证启动子的表达特性，将NtDFR和NtFLS启动子取代植物表达载体pBI121上35S启动子，构建pBI121-pNtDFR::GUS载体和pBI121-pNtFLS::GUS载体，利用农杆菌转化烟草叶片瞬时表达，通过GUS组织染色法确定了克隆的启动子的活性。注射NtDFR和NtFLS启动子烟草叶片GUS颜色变蓝，说明NtDFR和NtFLS启动子具有启动子活性。
3. 将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6、NtMYB7和NtMYB8分别和NtDFR启动子植物表达载体共同注射烟草进行瞬时表达， GUS组织化学染色结果显示NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6和NtMYB7使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅，定量PCR结果显示GUS基因表达量下降；而NtMYB8使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变深以及GUS基因表达量上升。表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6和NtMYB7抑制NtDFR启动子活性，NtMYB8能激活NtDFR启动子活性。
4. 将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6、NtMYB7和NtMYB8分别和NtFLS启动子植物表达载体共同注射烟草进行瞬时表达， GUS组织化学染色结果表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB5和NtMYB8使NtFLS启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅，定量PCR结果显示GUS基因表达量下降；而NtMYB4、NtMYB6和NtMYB7使NtLFS启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变深以及GUS基因表达量上升。表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB5和NtMYB8抑制NtLFS启动子活性，NtMYB4、NtMYB6和NtMYB7激活NtLFS启动子活性。
5. 提取中国水仙花瓣的RNA,反转录为cDNA,并以此为模板，根据已发表的中国水仙‘金盏银台’LYCE和LYCB基因全长序列设计引物分别扩增出204 bp的NtLYCE和188 bp的NtLYCB保守片段，以pKANNEL质粒及pTCK303植物表达载体为基础构建NtLYCE和NtLYCB双基因RNAi载体pTCK-LYCE/LYCB RNAi，在一个表达框内同时抑制NtLYCE和NtLYCB的表达；此外，扩增出促进开花的NtFT编码区全长序列，插入pTCK-LYCE/LYCB RNAi载体构建成pTCK-LYCE/LYCB-RNAi-FT双价植物表达载体。
主要研究内容及得到的结果如下:
1. 本研究采用染色体步移法从中国水仙中分别克隆了NtDFR和NtFLS基因起始密码子上游962 bp和968 bp的启动子序列。Genbank登录号为JX310698和MH472580。生物信息学分析结果表明，NtDFR和NtFLS启动子序列除包含TATA-box、CAAT-box等基本启动子元件外，还包含光调控元件、植物激素响应元件、胁迫响应元件等多个顺式作用元件。此外，NtDFR和NtFLS启动子序列还含有MYB转录因子结合位点。
2. 为验证启动子的表达特性，将NtDFR和NtFLS启动子取代植物表达载体pBI121上35S启动子，构建pBI121-pNtDFR::GUS载体和pBI121-pNtFLS::GUS载体，利用农杆菌转化烟草叶片瞬时表达，通过GUS组织染色法确定了克隆的启动子的活性。注射NtDFR和NtFLS启动子烟草叶片GUS颜色变蓝，说明NtDFR和NtFLS启动子具有启动子活性。
3. 将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6、NtMYB7和NtMYB8分别和NtDFR启动子植物表达载体共同注射烟草进行瞬时表达， GUS组织化学染色结果显示NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6和NtMYB7使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅，定量PCR结果显示GUS基因表达量下降；而NtMYB8使NtDFR启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变深以及GUS基因表达量上升。表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6和NtMYB7抑制NtDFR启动子活性，NtMYB8能激活NtDFR启动子活性。
4. 将中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2、NtMYB3、NtMYB4、NtMYB5、NtMYB6、NtMYB7和NtMYB8分别和NtFLS启动子植物表达载体共同注射烟草进行瞬时表达， GUS组织化学染色结果表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB5和NtMYB8使NtFLS启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变浅，定量PCR结果显示GUS基因表达量下降；而NtMYB4、NtMYB6和NtMYB7使NtLFS启动子诱导的烟草叶片GUS颜色变深以及GUS基因表达量上升。表明NtMYB2、NtMYB3、NtMYB5和NtMYB8抑制NtLFS启动子活性，NtMYB4、NtMYB6和NtMYB7激活NtLFS启动子活性。
5. 提取中国水仙花瓣的RNA,反转录为cDNA,并以此为模板，根据已发表的中国水仙‘金盏银台’LYCE和LYCB基因全长序列设计引物分别扩增出204 bp的NtLYCE和188 bp的NtLYCB保守片段，以pKANNEL质粒及pTCK303植物表达载体为基础构建NtLYCE和NtLYCB双基因RNAi载体pTCK-LYCE/LYCB RNAi，在一个表达框内同时抑制NtLYCE和NtLYCB的表达；此外，扩增出促进开花的NtFT编码区全长序列，插入pTCK-LYCE/LYCB RNAi载体构建成pTCK-LYCE/LYCB-RNAi-FT双价植物表达载体。