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目的了解5岁以下儿童中,医院相关肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,SP）的耐药情况,耐药谱及耐药机制。掌握肺炎链球菌的血清型、MLST（Multilocus sequence typing）分型和毒素基因,并深入探究不同分子型别SP菌株间的耐药表型、耐药基因和毒素基因的差异,为临床上SP相关疫苗的研发提供重要的数据支持,也为预防和控制肺炎链球菌相关疾病提供重要的理论基础。方法本研究采用医院为基础的监测研究,采集柳州地区5岁以下儿童的临床标本,并通过传统生化试验来鉴定和确认SP菌株。通过E-test测试进行SP菌株的抗生素敏感性试验。应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）鉴定菌株的血清型、耐药基因和毒素基因（荚膜结构毒素基因和菌毛结构毒素基因）。采用多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）进行菌株的序列分型（Sequence Type,ST）的鉴定;通过eBURST分析方法进行菌株的克隆群（Clonal Complex,CC）鉴定。分类变量的比较采用?2检验或Fisher确切概率法;综合应用最小生成树和相应的分析（对应分析）来揭示血清型与ST分型之间的潜在关系。应用多因子降维法（Multifactor Dimensionality Reduction,MDR）探索肺炎链球菌疫苗（PCVs）覆盖血清型和疫苗没有覆盖血清型菌株中分子特征的差异性和交互作用。结果1.研究对象的基本特征:共537名SP感染的≤5岁儿童。研究对象年龄为0?60个月,平均年龄(P25P75)为12.0（7.227.0）个月。537名儿童中,527名（98.1%）被诊断为非侵入性疾病（包括419名肺炎,48名支气管炎,37名中耳炎和23名上呼吸道感染）,10名（1.9%）被诊断为侵袭性疾（包括8名菌血症和2名胸膜炎患者）。2.耐药性:本研究所有SP菌株对万古霉素敏感。大多数SP菌株对青霉素G（98.3%）和左氧氟沙星（98.7%）敏感,但大多SP菌株对克林霉素（94.4%）,红霉素（93.8%）,四环素（86.4%）,复方新诺明（80.3%）和阿奇霉素（77.5%）耐药。83.8%的菌株对红霉素和四环素均耐药。erm（B）（92.6%）和mef（A/E）（56.4%）为主要的红霉素耐药基因,54.0%同时携带这两种大环内酯类耐药基因。tet（M）（95.5%）和tet（O）（2.8%）基因是SP菌株主要的四环素耐药基因。值得注意的是,同时携带tet（M）和erm（B）两种基因的SP共489株（91.1%）,同时携带tet（M）和mef（A/E）基因的SP共299株（55.7%）,同时携带tet（M）,erm（B）和mef（A/E）三种基因的SP共286株（53.3%）。3.分子特征:在537株SP菌株中,有514株（95.7%）SP成功进行血清分型,共检测出16种血清型。主要血清型为19F型,其次是血清型6B,19A,23F,14。PCV7血清覆盖率为73.7%,PCV10血清覆盖率为74.3%,PCV13血清覆盖率为85.8%。PCV13（P=0.002）和PCV10（P=0.045）在0-12月、13-24月、25-60月三个年龄组间差异均有统计学意义,但三种PCV覆盖率在肺炎与非肺炎组儿童间的差异均无统计学意义（P均>0.05）。SP菌株的主要ST型别为ST271（33.0%）,其次是ST320（11.5%）,ST81（4.3%）,ST3173（4.3%）和ST876（3.4%）。主要的CC克隆株是CC271,其次是CC3173、CC81、CC3397和CC90。荚膜结构毒素基因有:lytA（95.7%）,ply（91.8%）、pspA（67.0%）和psaA（3.4%）。菌毛结构基因有:rlrA基因携带率为34.1%;sipA基因携带率为44.9%。4.不同型别SP菌株的耐药和毒素特征分析:不同血清型SP菌株的耐药和毒素特征存在的差异,主要表现为血清型19型（包括19F型和19A型）更容易对头孢噻肟、四环素和复方新诺明耐药,并主要携带mef（A/E）耐药基因和rlrA与sipA毒素基因。MDR分析结果表明,PCVs覆盖的血清型菌株sipA携带率明显高于疫苗未覆盖血清型菌株（PCV7:OR=2.39,95%CI=1.55-3.70;PCV10:OR=1.87,95%CI=1.87,1.22-2.86;PCV13:OR=18.33,95%CI=6.56-51.25）。不同ST型别SP菌株的比较发现,不同ST型别SP菌株的耐药和毒素基因之间存在差异,主要表现为ST271和ST320菌株更容易对头孢噻肟、四环素和复方新诺明耐药,并主要携带mef（A/E）耐药基因和rlrA、sipA毒素基因。5.SP菌株的血清型与ST型别的关联性分析:ST271/19F（32.6%）和ST320/19A（7.3%）是本研究的主要克隆株,本研究对应分析发现:血清型与ST间存在关联性（?2=2761.13,P<0.001）,表现为:血清型6A/B型与ST386、ST90、ST902、ST3173、ST1661、ST9789相关;血清型23F型与ST872、ST81、ST242、ST1437相关,血清型14型与ST876相关。6.主要STs/血清型菌株的表型和分子特征分析:不同STs/血清型克隆株与头孢噻肟（P<0.001）、四环素（P<0.001）、复方新诺明（P<0.001）的耐药性之间存在相关性。尽管对红霉素的耐药表型没有显著性差异（P>0.05）,但STs/血清型与mef（A/E）之间存在相关性（P<0.001）。其中ST271/19F和ST320/19A菌株主要与头孢噻肟、四环素和复方新诺明的耐药性有关,并更容易携带mef（A/E）耐药基因;ST271/19F和ST320/19A菌株更有可能携带rlrA、sipA基因。在所有ST3173/6B和大多数ST876/14克隆株中均不存在菌毛（rlrA和sipA）结构基因。结论（1）SP菌株主要对大环内酯类和克林霉素耐药,高达92.2%的菌株为多重耐药肺炎链球菌,主要耐药模式为对大环内酯类+克林霉素+四环素+复方新诺明同时不敏感。SP菌株检出的耐药基因主要是erm（B）、mef（A/E）和tet（M）。提示柳州地区5岁以下儿童医院相关SP的耐药情况比较严重,需对SP菌株耐药水平进行长期动态监测。（2）SP菌株的主要血清型别为19F、6B、19A、23F和14。PCV13疫苗的血清型覆盖率高达85.8%,提示柳州需要在儿童中引入和应用PCV13疫苗。（3）MDR分析提示sipA基因与PCVs覆盖的血清型具有关联性,在扩大范围的研究论证后,可为菌毛结构结合肺炎链球菌血清型新疫苗的研制提供新思路。（4）本研究发现SP的血清型和ST型别之间存在关联性,主要流行的克隆株是ST271/19F和ST320/19A。不同分子型别菌株之间的耐药和毒素特征存在差异,其中ST271/19F和ST320/19A克隆株与头孢噻肟、四环素和复方新诺明的耐药性及携带mef（A/E）、rlrA和sipA基因相关。提示监测菌株多重特征的价值,以发现新的流行病学趋势,并为多价肺炎链球菌疫苗的研制提供科学的理论依据。