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本研究黄河鲤(Cyprinus carpio)为试验对象,在对黄河鲤金属硫蛋白(Metallothionein,MT)基因的克隆及序列分析、黄河鲤MT基因的组织表达分析的基础上通过实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)监测分析水体铜胁迫下黄河鲤MT基因表达变化规律,以期从分子生物学角度为水体铜污染监测提供新的分子标志物。主要研究结果如下: 1、采用RT-PCR方法成功克隆了黄河鲤MT基因的编码区(Coding sequence,CDS)序列,全长183bp,共编码60个氨基酸,不含芳香族氨基酸和组氨酸,其中20个半胱氨酸(Cys)集中分布在肽链的氨基端(N-端)和羧基端(C-端),具有脊椎动物MT典型的Cys-X-Cys、Cys-X-X-Cys、Cys-X-Cys-Cys保守序列结构[1],预测分子量为6013D,理论等电点为8.38。经核苷酸多序列比对与高身鲫(Carassius cuvieri)同源性最高,为94%,氨基酸序列比对与稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)同源性最高,为95%。黄河鲤MT分子进化亲缘性与其生物学分类地位基本一致。 2、依据获取的黄河鲤MT基因片段合成高特异性的引物,采用优化退火温度及构建标准曲线提高引物扩增效率,逐步摸索并成功建立了监测黄河鲤MT基因表达水平的RT-qPCR的程序方法[2]。以β-actin为内参,分析了黄河鲤MT基因的表达具有明显的组织差异性,其中肝胰脏MT表达量最高,其次是肾脏、脑和鳃,肌肉中最少,其中以肌肉组织MT基因的相对表达量为基准单位―1‖,则肝胰脏的MT基因表达量为56,肾脏、脑和腮依次为16.6、7.9和3.4。 3、同时用0、0.10、0.30、0.60、1.0、1.5mg/LCu2+体外染毒刺激黄河鲤,采用PCR(RT-qPCR)监测分析不同时间点(6h、12h、24h、48h、96h、192h、12d、16d)肝胰脏、肾脏、腮、肌肉和脑组织金属硫蛋白(MT)基因的表达量。结果表明,铜诱导下黄河鲤MT基因均表达上调且具有明显的组织差异性:不同浓度间存在一定剂量-效应关系,在诱导的前期(0-96h)存在一定的时间-效应[3];不同组织间MT基因上调量不同,其中肝胰脏最多,其次为肾脏、鳃和脑,肌肉上调最少,在整个诱导期除肝胰脏MT基因表达量不断增加外,其他4个组织MT整体均呈先增高后下降的发展状态,但各个组织的诱导峰值及达到其诱导峰值的诱导时间不尽相同[4];肝胰脏、肾脏、鳃、脑和肌肉MT的主要诱导集中期分别为:0-48h、0-48h、0-24h、0-48h和0-12h。 结果表明,黄河鲤MT基因具有脊椎动物的高度保守序列,重金属铜胁迫下肝胰脏MT基因表达量持续升高,因此可以将黄河鲤肝胰脏MT作为实时监测养殖水环境重金属污染的生物标志物[5]。